沙枣种子总黄酮提取工艺优化及体外抗氧化性分析

凯迪日耶·玉苏普，蒋海明

（1.喀什大学生命与地理科学学院，新疆 喀什 844006；2.新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆 喀什 844006）

尖果沙枣（Elaeagnus oxycarpa Schlechtend）属胡颓子科胡颓子属，沙枣树适应性强，能在高盐高碱等极端环境中生长发育[1-2]。沙枣及其果实可用于食品、医药、香料和木材等领域[3]。尖果沙枣果实营养成分高，其含有大量的生物挥发油、不饱和脂肪酸、黄酮类化合物、维生素和其他生物活性化学物质[4]。黄酮类化合物是一类普遍存在于光合作用细胞中的天然化合物。截至目前，已分离鉴定出1万多种黄酮类化合物[5]。黄酮类化合物（通常指维P）是仅存在于植物中的具有苯并-γ-吡喃酮结构，可以分为不同类型，黄酮醇类、黄烷醇类、异黄酮类和黄烷-3-醇类[6]。黄酮类化合物有广泛的生物学功能，如抗氧化、降血脂、缓解疲劳、预防动脉粥样硬化等，研究发现黄酮类化合物比维C和维E具有更强的抗氧化潜力，因此对黄酮类化合物的研究越来越受到重视[7-8]。

有关沙枣种子中总黄酮提取工艺及体外抗氧化性相关的研究均未见国内外文献报道。新疆沙枣的分布面积广泛、生产量高、价格低。研究应用超声波提取沙枣种子的总黄酮，通过正交试验优化最佳提取条件，并采用DPPH自由基清除能力指数评价总黄酮的体外抗氧化活性，为充分利用沙枣资源、进一步开发黄酮类化合物提供了有益参考。

1 材料

1.1 材料

沙枣，采自新疆喀什地区岳普湖县沙枣林。沙枣果实取种子，自来水洗干净，烘干，并用粉碎机将沙枣种子粉碎，过40目筛，取筛出粉末，放4℃冰箱中备用。

1.2 试剂

甲醇（CH3OH）、亚硝酸钠（NaNO2）、硝酸铝（Al(NO3)3）、氢氧化钠（NaOH）、芦丁标准品、乙醇（CH3CH2OH）和1,1-二 苯 基-2-三 硝 基 苯 肼（DPPH试剂），以上试剂均为分析纯，国药化学试剂有限公司提供。

1.3 仪器与设备

MS-01h型磁力搅拌器，广州立珠生物科技有限公司产品；E204e/02型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品中；T6型新世纪紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产品；SHB-III型循环水式真空泵，武汉华科达实验设备有限公司产品；CQ-300B型超声波清洗机，上海量壹科学仪器有限公司产品；ZF-06a型脂肪测定仪，上海瑞正仪器设备有限公司产品；UP-II-20t型优普超纯水器，四川优普超纯科技有限公司产品；Re-52aa型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品。

2 方法与结果

2.1 标准曲线的制备

参考林文珍等人[9]、蒋丽施等人[10]方法并略做修改。准确称取芦丁标准品10 mg，于105℃下干燥至恒质量，加入甲醇溶液45 mL。待芦丁标准品完全溶解后，甲醇溶液定容至50 mL，得到质量浓度0.19 mg/mL的芦丁标准溶液。用可调节微量移液器将0，1，2，3，4，5 mL芦丁标准溶液加入到6支干燥的棕色容量瓶中，取质量分数为4%的NaNO2水溶液1 mL，依次加入到以上6支容量瓶中，混匀静置6 min，再取质量分数为10%的Al(NO3)3水溶液1 mL依次加入到棕色容量瓶中，摇匀后静置6 min，最后加入质量分数为4%的NaOH溶液10 mL，加水至25 mL刻度线进行定容。摇匀后，静置15 min进行显色。将相应的溶剂作为空白对照试验，于波长510 nm处测量吸光度A，重复3次，并进行线性相关性考查。

以芦丁标准质量浓度（mg/mL）为横坐标，于波长510 nm处的吸光度A为纵坐标，制作标准曲线。线性回归方程为Y=11.267X+0.002 4，R2=0.998。结果表明，线性回归方程具有良好的相关性，以0.007 6～0.038 0 mg/mL质量浓度范围以内，线性关系良好。

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

2.2 供试品溶液的制备

用电子天平称取1 g沙枣种子粉末，用滤纸包好，用体积分数为70%的乙醇溶液浸泡2 h。然后于60℃条件用下回流提取1 h，提取液定容至50 mL，得供试品溶液，放4℃冰箱备用。按照2.1中的方法，测定吸光度A，根据标准曲线的回归方程得出提取液中黄酮的质量浓度，根据黄酮质量浓度计算公式计算黄酮含量。黄酮含量计算公式如下：

式中：C——代入线性回归方程测定总黄酮的质量浓度，mg/mL；

D——稀释倍数；

V——供试液的体积，mL；

m——种子粉末的质量，g；

2.3 方法学考查

2.3.1 稳定性试验

精密量取芦丁标准品溶液3 mL及供试品提取溶液3 mL。参照2.1中的方法，分别在5，10，20，40，50，60 min，于波长510 nm处测定对照品和供试品提取溶液的吸光度A，观察亚硝酸钠-硝酸铝比色法对黄酮显色效果的稳定性。结果表明，对照品吸光值RSD=2.003%（n=6），供试品吸光度RSD=4.106%（n=6），说明对照品、供试品提取溶液1 h以内具有较好的稳定性。

稳定性试验结果见表1。

表1 稳定性试验结果

2.3.2 精密度试验

精密量取5份同一来源的对芦丁标准溶液和5份同一来源的供试品提取溶液，每份用可调节微量移液器吸取3 mL溶液。参照2.1中的方法，测定其吸光值并计算RSD值，以便考查试验方法的精密度。结果表明，对照品溶液吸光度RSD=1.203%（n=5），供试品提取溶液吸光度RSD=4.706%（n=5）。结果表明该方法精密度良好。

精密度试验结果见表2。

表2 精密度试验结果

2.3.3 重复性试验

精密称取5份沙枣种子粉末，每份为1.0 g，根据2.2供试品提取溶液的制备方法，制备5份供试品提取溶液。参照2.1中的方法，测定其吸光度，计算RSD值，考查试验的重复性。结果表明，供试品吸光值RSD=3.24%（n=5），说明该试验方法重复性较好。

重复性试验结果见表3。

表3 重复性试验结果

2.3.4 加样回收率试验

精密称取3份沙枣种子粉末，每份为1.0 g，按照2.2供试品溶液的制备方法和工艺来制作供试品提取溶液。得到供试品溶液后，各取3 mL在25 mL棕色容量瓶中备用，依次加入0.19，0.38，0.54 mg的芦丁标准品溶液，参考2.1的方法，于波长510 nm处测定溶液的吸光度，测定总黄酮含量，计算回收率RSD，考查加样回收率。结果表明，3次回收率测定的平均值为104.61%，RSD=4.65%（n=3），说明用该方法测定黄酮含量的准确度高，方法可靠。

回收率试验结果见表4。

表4 回收率试验结果

2.4 超声提取与回流取方法比较

2.4.1 乙醇超声提取法

称取1 g沙枣种子粉末，将沙枣种子粉末在体积分数为95%乙醇溶液50 mL中浸泡2 h，设置超声功率300 W，提取时间0.5h。用水浴循环真空泵过滤，滤渣中再加入体积分数为95%的乙醇溶液50 mL，设置超声功率300 W，提取时间0.5 h。用水浴循环真空泵过滤，合并2次滤液得到提取液定容至100 mL棕色容量瓶中。将上述提取液稀释5倍，精密量取3 mL溶液放置在25 mL棕色容量瓶中。参照2.1中的方法，测定其吸光度，并按照公式计算总黄酮含量。

2.4.2 乙醇回流提取法

称取1 g沙枣种子粉末，将沙枣种子粉末在体积分数为95%乙醇溶液50 mL中浸泡2 h，索氏提取法60℃下回流提取1 h，提取2次。合并2次的乙醇提液，定容至100 mL。将上述提取液稀释5倍，精密量取3 mL溶液放置在25 mL容量瓶中备用。参照2.1中的方法，测定其吸光度，并按照公式计算总黄酮含量。由表6可知，与回流提取法相比，超声提取法提取的黄酮得率要比回流提取法提取出的黄酮得率高。

不同提取方法提取效果比较见表5。

表5 不同提取方法提取效果比较

2.5 正交试验设计

精确称9分沙枣种子粉末，每份为1.0 g。按照L9（34）正交试验设计表（见表6）中确定的加入乙醇用量、加入乙醇的体积分数、提取时间和提取次数共4个因素条件，超声波提取法提取总黄酮。参照2.1中的方法，测定其吸光值，按照公式计算总黄酮含量。通过正交设计软件对数据进行分析，4个因素对于总黄酮提取的影响大小分别为提取次数（D）＞料液比（A）＞提取时间（C）＞乙醇体积分数（B）。对K1、K2、K3值的比较，各因子水平的基本影响为A3＞A2＞A1，B2＞B1＞B3，C3＞C1＞C2，D2＞D3＞D1。经 过 四因素三水平的综合考查，沙枣种子中总黄酮的提取最优条件是A3B2C1D3，即乙醇加量30倍，乙醇体积分数70%，提取时间0.5 h，提取次数3次，所得的黄酮含量最高为5.077 mg/g。

正交试验因素与水平设计见表6，正交试验表及结果见表7。

表6 正交试验因素与水平设计

表7 正交试验表及结果

2.6 最佳提取工艺验证试验

根据试验结果优选出来的最优工艺参数A3B2C1D3，按照30倍乙醇用量，乙醇体积分数为70%，提取时间0.5 h和提取次数3次进行验证试验。

正交试验验证见表8。

表8 正交试验验证

试验结果表明，通过验证试验得到的平均总黄酮含量平均为5.102 mg/g，RSD＜1%。通过验证试验所得的黄酮含量与最佳工艺所得结果基本一致，说明该方法稳定可靠，验证了提取工艺的可行性。

2.7 对DPPH自由基清除能力的测定

准备5支25 mL棕色容量瓶，依次向容量瓶加入已知浓度的供试品溶液。然后向每个容量瓶中加入0.01 mg/mL DPPH溶液4 mL，加水定容至刻度，摇匀。于波长517 nm处测定吸光试，记作A0；室温避光静置30 min，记录波长517 nm处吸光度，记作Aj；对照组试验为只加DPPH的水溶液，吸光度记作Ap按照以下公式计算出自由基清除率W。

沙枣种子黄酮提取液对DPPH自由基清除效果见图2。

由图2可知，沙枣种子的乙醇提取物对于DPPH自由基具有一定的清除作用，并且随着浓度的增加，对于氧自由基的清除率也在增强，但是清除率较低。

图2 沙枣种子黄酮提取液对DPPH自由基清除效果

3 结论

沙枣果、花、叶、枝均含有多种有益的营养成分，具有较高的应用开发潜力和经济价值[11]。沙枣中含有黄酮、多糖、芳香油等重要的生物活性成分，沙枣叶、花、果实、种子中富含黄酮类化合物，黄酮类化合物的物学功能广泛，具备多种药理学作用，研究发现沙枣中黄酮类化合物的含量约为0.68%～1.16%[12-13]。由此可见，沙枣是一种环境效益与经济效益相结合的盐生植物，是一种具有开发市场前景的重要资源。作为重要的植物资源，沙枣的重要性被大家忽视，资源开发不够充分。现阶段，只有一小部分大枣用于民间药用，采摘或基本生产加工，食用或初步加工，利用率极低，更谈不上综合开发利用，导致如此宝贵的资源被大量浪费。

黄酮类化合物是植物独特的次生代谢产物。对于植物本身而言，黄酮类化合物在植物生理和生态等方面中发挥着多种作用，包括保护植物免受紫外线和病原菌的伤害、吸引昆虫授粉、调节植物的雄性生育力、调控细胞周期，并参与植物激素的运输等[14]。从其经济开发和应用来看，黄酮类化合物有重要的药用价值，对许多人类疾病具有治疗效果。黄酮类化合物具有抗癌、抗氧化、抗炎、降低血管脆性等多种功能。因此，对黄酮类等化合物的研究和应用逐渐成为热点[15]。

研究采用超声法提取技术对尖果沙枣中总黄酮的提取条件及体外抗氧化活性进行初步研究，确定最佳提取工艺参数为乙醇用量30倍，乙醇体积分数70%，提取时间0.5 h，提取次数3次，在以上工艺优选条件下重复试验3次，平均提取含量5.102 mg/g。研究结果表明，沙枣种子黄酮类化合物具有DPPH自由基清除作用，并具有一定的体外抗氧化活性。研究旨在提高尖果沙枣资源的合理利用率，为进一步开发尖果沙枣黄酮类在天然药物领域应用、开发研究等方面提供了有益参考依据。