盐胁迫和接种丛枝菌根真菌对榉树根系的影响1)

曾婧祎朱凌骏马仕林 张金池 王金平 刘京 聂晖 陈美玲

(南京林业大学，南京，210037)(国电环境保护研究院有限公司)(南京林业大学)

由于全球气候变化和不合理的土地利用，土壤盐渍化问题日益严重，对全球约9.6×108hm2可耕地造成危害[1]。盐碱地面积持续增加，严重制约了农林业的发展[2]。植物根系连接着土壤与植株，在植物水分吸收再分配[3]和养分周转中起着至关重要的作用[4]；然而，过高的土壤盐分会抑制根系延伸及细根生长[5]，促使根系产生氧化应激反应[6]，吸收水分及养分的能力受限，进而影响植株生长发育[7]。丛枝菌根真菌(AMF)广泛存在于各类土壤中，能与多数植物形成良好的共生关系[8]，并通过多种途径提高植物抗逆性[9]，进而调节植物生长[10]。已有研究表明，丛枝菌根真菌形成的菌丝网络，可促进土壤矿质养分溶解、改善土壤结构[11]、调节根系渗透平衡[12]、提高水分利用及养分吸收[13]、促使根系生长及干物质积累，进而更好地支撑植株[14]，提高植株对盐胁迫的耐受性。

榉树(ZelkovaserrataThunb)又名大叶榉，为榆科(Ulmaceae)榉属(Zelkova)的硬阔叶乔木。榉树高大叶厚，耐烟尘且抗风性强，是水土保持的优良树种[15]，有良好的经济和生态价值[16]。已有研究表明，过高的土壤盐分会抑制榉树种子萌发[17]，造成榉树叶片枯焦蔫萎[18]，甚至导致植株死亡[19]。对盐胁迫环境丛枝菌根真菌对榉树影响的研究，多集中于光合特性和生理特征[20-22]，但关于盐胁迫环境丛枝菌根真菌对榉树根系影响的研究较少；丛枝菌根真菌作为植物内生真菌，其定殖及繁殖过程，集中于植物根系及根际[23]，但关于盐胁迫环境菌根共生体及其土壤环境的综合研究较少。

为此，本研究以榉树幼苗为试验对象，分别接种摩西球囊霉(Glomusmosseae)、扭形球囊霉(Glomustortuosum)，待菌根真菌侵染后，进行盐胁迫试验。每种处理选取3株长势一致的幼苗，测定幼苗侵染率、根系形态、根系氮磷养分及酶活性；采集根际土，测定根际土的全磷、全氮、有效磷、碱解氮；分析盐胁迫和丛枝菌根真菌对榉树根系的协同影响。旨在为沿海防护林营建提供技术参考。

1 材料与方法

将榉树(ZelkovaserrataThunb)种子与湿度为60%的湿沙，按照质量比m(种子)∶m(湿沙)为1∶3的比例混匀，在冰箱内4 ℃做沉积处理；处理期间，定期洒水保持沙的湿度，并翻动种子确保良好的通气；时间不少于30 d。沉积好的种子用质量浓度为3 g/L的KH2PO4溶液浸泡24 h，然后在体积分数为75%的乙醇溶液中浸泡5 min后用蒸馏水冲洗干净。在恒温气候箱内25 ℃催芽；以灭菌后的珍珠岩、草炭土，按照体积比为V(珍珠岩)∶V(草炭土)=1∶1混合作为基质土培养限菌苗(无丛枝菌根真菌侵染的幼苗)。

根据前期调查[24]，以摩西球囊霉(Glomusmosseae)、扭形球囊霉(Glomustortuosum)为供试菌株，菌株由北京市农林科学院植物营养与资源研究所提供。培养榉树幼苗的同时，以玉米和三叶草为寄主，灭菌的黄沙为基质，在人工气候室培养3个月，进行丛枝菌根真菌(AMF)的扩繁，保留含有孢子、菌丝及侵染根段的黄沙混合物作为接种物。

2017年6月份在南京林业大学下蜀林场温室进行盆栽试验，温室条件：温度18～35 ℃，相对湿度40%～80%，昼夜光周期昼14 h、夜10 h，光合有效辐射700～1 000 μmol·m-2·s-1。选择苗高约10 cm、地径约1 mm、长势一致的榉树限菌苗为供试幼苗，分别接种摩西球囊霉、扭形球囊霉，以不接种丛枝菌根真菌为对照(CK)，每种处理24盆，每盆基质约2.5 kg；以下蜀林场林地5～30 cm的表层土、黄沙、蛭石，等体积混合作为盆栽基质，混合基质在高温高压灭菌后于温室内放置至少2周。接菌后，温室培育盆栽1 a作为丛枝菌根真菌的侵染期、植物生长期；期间每周浇试验设计的在原“霍格兰营养液(缺磷、不含硝酸钙)”基础上补加磷质量分数为25%的改进营养液1次(每盆300 mL)，并适当补充无菌蒸馏水。

接菌后温室培养3个月，测定菌根真菌侵染率，培养至2018年6月，进行盐胁迫处理。每种菌处理分别设置4个浓度盐胁迫处理(0、50、100、150 mmol·L-1)，各12个重复，每次每盆浇500 mL，1周1次，共进行2个月；期间定期补充试验设计的在原“霍格兰营养液(缺磷、不含硝酸钙)”基础上补加磷质量分数为25%的改进营养液。2018年9月，每种处理选取3株长势一致的幼苗，用于测定侵染率、根系形态、根系氮磷养分及酶活性，采集根际土用于测定全磷、全氮、有效磷及碱解氮。

菌根侵染率测定：将存放于甲醛-乙酸-乙醇(FAA)固定液中的1 cm根段洗净，用质量分数为10%的KOH溶液在90 ℃浸泡1 h后，加入质量分数为0.05%的曲利苯蓝溶液在70 ℃染色。每个样品随机选取30个根段，用荧光显微镜观察菌根侵染程度，拍照并统计根段侵染率[24]，菌根侵染率=(被侵染的根段长度/检查的根段总长度)×100%。

根系特征及养分测定：完整取出并洗净每种处理所选取的3株幼苗根系，用滤纸吸干，将根平展开用根系扫描仪LA2400(Expression 1200XL，EPSON，Long Beach，CA，USA)扫描，用根系分析系统软件(WinRhizoPro5.0)计算根长度、根表面积、根尖数[25]。根系全磷的测定，参照文献[26]的方法，用H2SO4-H2O2消煮-钒钼黄比色法测定；根系中的全氮，由元素分析仪测定。

根系酶活性测定：硝酸还原酶(NR)的活性，参照文献[27]测定；谷胱甘肽还原酶(GR)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶(NOX)活性，参考文献[28]的方法测定。

根际土壤养分测定：运用元素分析仪测定土壤全氮质量分数，碱解扩散法[29]测定土壤碱解氮质量分数，采用钼锑抗分光光度法[30]测定全磷、有效磷质量分数。

数据处理：运用Microsoft Excel2019对数据进行整理，用软件SPSS 26(SPSS 26.0，SPSS Ltd，USA)进行数据的单因素(邓肯(Duncan)检验)、双因素方差分析。

CK为未侵染根段；GM为摩西球囊霉侵染根段；GT为扭形球囊霉侵染根段。V为泡囊；H为菌丝；A为丛枝；S为孢子。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫和接种丛枝菌根真菌对榉树根系侵染率的影响

由表1可见：盐胁迫和接种丛枝菌根真菌，对榉树根系侵染率的影响均显著(P<0.05)，二者对根系侵染率有显著的交互作用(P<0.05)。接种摩西球囊霉的榉树菌根侵染率，高于接种扭形球囊霉的榉树菌根侵染率；且随着盐浓度的增加，接种摩西球囊霉、扭形球囊霉，对榉树菌根侵染率均呈现下降趋势。当盐浓度为0、100、150 mmol/L时，接种摩西球囊霉的榉树菌根侵染率，均显著高于接种扭形球囊霉的榉树菌根侵染率。

表1 不同浓度盐胁迫处理时接种丛枝菌根真菌榉树根系的菌根侵染率

2.2 盐胁迫和接种丛枝菌根真菌对榉树根系形态的影响

由表2可见：盐胁迫、接种丛枝菌根真菌，对榉树根表面积、根长度、根尖数均有显著影响(P<0.05)。无论接菌与否，榉树根系的根表面积、根长度、根尖数，均随着盐浓度增加的胁迫处理而降低。盐浓度为50 mmol·L-1时，接种摩西球囊霉榉树根系的根表面积，显著高于不接种丛枝菌根真菌榉树根系的根表面积。当盐浓度为100 mmol·L-1时，接种摩西球囊霉榉树的根表面积、根长度、根尖数，均显著高于接种扭形球囊霉、不接种丛枝菌根真菌榉树的根表面积、根长度、根尖数。

表2 不同浓度盐胁迫处理时接种丛枝菌根真菌榉树菌根苗根系的生长量

盐浓度/mmol·L-1根长度/cm不接种丛枝菌根真菌接种摩西球囊霉接种扭形球囊霉 0(14850.61±1751.48)Aa(17508.18±2206.69)Aa(17172.02±1106.65)Aa50(12746.93±307.50)ABa(13876.84±987.92)Ba(12544.21±494.10)Ba100(10828.55±900.92)Bb(12264.75±735.75)Ba(10596.18±326.59)Cb150(8080.17±1299.25)Ca(8780.82±522.57)Ca(8083.39±742.39)Da

盐浓度/mmol·L-1根尖数量不接种丛枝菌根真菌接种摩西球囊霉接种扭形球囊霉 0(88986.33±6009.46)Aa(109852.67±20696.35)Aa(99185.67±11744.97)Aa50(72253.67±4989.54)Ba(82723.67±6613.94)Ba(75956.67±4009.4)Ba100(60613.00±1794.20)Cb(72302.00±4061.41)BCa(64301.67±2181.22)Bb150(45083.33±8577.90)Da(55885.33±7077.60)Ca(45868.67±4985.59)Ca

2.3 盐胁迫和接种丛枝菌根真菌对榉树根系氮磷质量分数的影响

由表3可见：接种丛枝菌根真菌、盐胁迫，对榉树根系磷质量分数均有显著的影响(P<0.05)；接种丛枝菌根真菌对根系氮质量分数的影响不显著，而盐浓度对根系氮质量分数有显著影响(P<0.05)。无论接菌与否，榉树根系磷质量分数均随盐浓度的增加而呈现下降趋势。当盐浓度为150 mmol·L-1时，接种摩西球囊霉的榉树根系磷质量分数，显著高于不接种丛枝菌根真菌的榉树根系磷质量分数；接种扭形球囊霉的榉树根系磷质量分数，均低于不接种丛枝菌根真菌的榉树根系磷质量分数。当盐浓度达到150 mmol·L-1时，接种扭形球囊霉的榉树根系磷质量分数，显著低于不接种丛枝菌根真菌、接种摩西球囊霉的榉树根系磷质量分数。随盐浓度的增加，不接种丛枝菌根真菌、接种扭形球囊霉的榉树根系氮质量分数，均呈上升趋势；非盐胁迫时，接种扭形球囊霉的榉树根系氮质量分数，显著低于接种摩西球囊霉的榉树根系氮质量分数。

表3 不同浓度盐胁迫处理时接种丛枝菌根真菌榉树菌根苗根系的氮磷质量分数

2.4 盐胁迫和接种丛枝菌根真菌对榉树根系酶活性的影响

由表4可见：接菌处理、盐胁迫处理，对榉树根系硝酸还原酶活性的影响均不显著；但接菌处理和盐胁迫处理的交互作用，对榉树根系硝酸还原酶活性的影响显著(P<0.05)；接种丛枝菌根真菌、盐胁迫处理，均对榉树根系烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性影响显著(P<0.05)，但接菌处理和盐胁迫处理，对榉树根系烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性影响不显著；谷胱甘肽酶活性仅受盐胁迫的作用有显著的影响(P<0.05)。随着盐浓度增加，不接种丛枝菌根真菌和接种摩西球囊霉的榉树根系硝酸还原酶活性逐渐下降，接种扭形球囊霉的榉树根系硝酸还原酶活性随盐浓度上升而增强。无盐胁迫处理的，接种扭形球囊霉的榉树根系硝酸还原酶活性，显著低于不接种丛枝菌根真菌、接种摩西球囊霉的榉树根系硝酸还原酶活性。当盐浓度达到100、150 mmol·L-1时，接种扭形球囊霉的榉树根系硝酸还原酶活性，显著高于接种摩西球囊霉、不接种丛枝菌根真菌的榉树根系硝酸还原酶活性。榉树根系的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性，随盐浓度上升呈现先增加后减少的趋势。各浓度盐胁迫处理时，接种摩西球囊霉的榉树根系烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性，均显著高于不接种丛枝菌根真菌的榉树根系烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性。盐浓度为100、150 mmol·L-1时，接种摩西球囊霉的榉树根系烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性，显著高于接种扭形球囊霉的榉树根系烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性；盐浓度为150 mmol·L-1时，接种扭形球囊霉的榉树根系烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性，显著高于不接种丛枝菌根真菌的榉树根系烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性。无论盐胁迫与否，接种丛枝菌根真菌的榉树根系谷胱甘肽还原酶活性均无显著变化。

表4 不同浓度盐胁迫处理时接种丛枝菌根真菌榉树菌根苗根系的酶活性

2.5 盐胁迫和接种丛枝菌根真菌对榉树根际土壤养分的影响

由表5可见：盐胁迫处理对榉树菌根苗根际土壤有效磷、全磷、碱解氮、全氮质量分数，均有显著影响(P<0.05)；接种丛枝菌根真菌对榉树菌根苗根际土壤全磷、碱解氮质量分数有显著影响(P<0.05)。随盐浓度上升，不接种丛枝菌根真菌、接种摩西球囊霉的榉树根际土壤有效磷质量分数，均呈上升趋势。盐浓度为50 mmol·L-1时，接种扭形球囊霉的榉树菌根苗根际土壤有效磷质量分数，显著低于不接种丛枝菌根真菌的榉树根际土壤有效磷质量分数。不接种丛枝菌根真菌的榉树根际土壤碱解氮质量分数，随着盐浓度的增加波动上升。盐浓度为150 mmol·L-1时，接种摩西球囊霉的榉树根际土壤碱解氮质量分数，显著低于不接种丛枝菌根真菌的榉树根际土壤碱解氮质量分数。

盐浓度/mmol·L-1碱解氮质量分数/mg·kg-1不接种丛枝菌根真菌接种摩西球囊霉接种扭形球囊霉全氮质量分数/mg·g-1不接种丛枝菌根真菌接种摩西球囊霉接种扭形球囊霉 0(0.06±0.01)Ca(0.05±0.02)Ba(0.06±0.03)Ca(46.67±5.77)Aa(46.67±5.77)Ba(43.33±5.77)Ba50(0.16±0.04)ABa(0.15±0.04)Aa(0.11±0.02)Ba(56.67±5.77)Aa(56.67±5.77)ABa(46.67±5.77)Ba100(0.14±0.03)Ba(0.11±0.02)ABa(0.13±0.02)Ba(53.33±5.77)Aa(60.00±0)Aa(60.00±0)Aa150(0.20±0.04)Aa(0.13±0.04)Ab(0.18±0.03)Aab(50.00±0)Aa(60.00±10)Aa(60.00±10)Aa

2.6 盐胁迫和接种丛枝菌根真菌对榉树根系性状及根际土壤养分相关性的影响

由表6可见：盐浓度，与榉树根长度、根表面积、根尖数及根系磷质量分数呈显著负相关，与根系氮质量分数及根际土壤碱解氮、全氮、有效磷、全磷质量分数均呈显著正相关关系。菌根侵染率，与榉树根长度、根表面积、根尖数及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性呈显著正相关，与根系氮质量分数、土壤碱解氮质量分数、土壤有效磷质量分数呈显著负相关。榉树根长度、根表面积、根尖数，与根系磷质量分数呈显著正相关，与根系氮质量分数及根际土壤碱解氮、全氮、有效磷、全磷质量分数呈显著负相关，与榉树根系谷胱甘肽还原酶、硝酸还原酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性不相关。根系氮质量分数，与根际土壤碱解氮、全氮、有效磷、全磷质量分数呈显著正相关；而根系磷质量分数，与盐浓度及根际土壤碱解氮、全氮、有效磷、全磷质量分数呈显著负相关，与根系谷胱甘肽还原酶、硝酸还原酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性及菌根侵染率均不相关。

表6 盐胁迫处理和接种丛枝菌根真菌与榉树根系性状、根际土壤养分的相关系数

3 讨论与结论

过高的土壤盐分会对植物产生渗透胁迫和离子毒害，导致植物衰弱甚至死亡[31]，严重阻碍农林业发展。大量研究表明，丛枝菌根真菌能提高植物对非生物胁迫的抗逆性，提高植物的生产能力[32]。榉树作为沿海防护林常用树种，其与丛枝菌根真菌形成的共生体亟待进一步探究。

菌根侵染率与植物和丛枝菌根真菌之间的亲和力有关[33]，亲和力强则菌根侵染率高[34]。本研究中，摩西球囊霉对榉树根系的侵染率高于扭形球囊霉对榉树根系的侵染率，而已有研究表明，不同种类的丛枝菌根接种与植物形成的联合体对于土壤的反馈作用存在差异[35]，表明不同菌种对植物的亲和力是有着差异的[36-37]。丛枝菌根真菌对草莓根系的侵染率与盐胁迫呈显著负相关[38]，侵染率随盐浓度升高而降低，表明较高的盐浓度会限制丛枝菌根真菌孢子的萌发和菌丝的延伸，导致侵染能力受限[36]，进而降低丛枝菌根真菌对植物根系的侵染率[39-42]。

根系通过机械支撑、养分输送、气体交换以及与有益微生物共生等方式促进植物生长[43]，使得植物能够耐受盐、酸、虫害等生物和非生物胁迫[44]。植物根长度、根表面积是反映根系功能和生长的重要指标[45]，过高的盐浓度会抑制植物根系活性[6]，限制根系伸长，降低根系生长量[46]。本研究中，无论接菌与否，盐浓度均显著降低了榉树根表面积、根长度、根尖数。菌根侵染率与榉树根表面积、根长度、根尖数呈显著正相关，表明丛枝菌根真菌的侵染，能显著提高植物根系在盐胁迫下的生长能力[47]，增加根系的生长量[48-49]。同时，接种摩西球囊霉榉树的根表面积、根长度、根尖数，高于接种扭形球囊霉榉树的根表面积、根长度、根尖数，说明不同菌种与植物形成的共生体效用存在差异[37]。

氮、磷是植物所需的重要元素[50]，在植物生长发育过程中起着关键作用。已有研究表明，根际是植物能量物质转化最活跃的区域，根际土壤中氮磷质量分数与植物生命有直接联系[51]。盐胁迫导致土壤养分贫乏[52]，阻碍植物对养分的吸收[53]。丛枝菌根真菌能活化土壤中的速效养分和矿质养分[54]，以供植物吸收利用[55]。此外，丛枝菌根真菌的菌丝，通过扩大根系吸收面积增加矿质养分和水分的吸收[56]，促进丛枝菌根真菌与寄主植物之间的养分输送[55]。本研究中，无论接菌与否，随盐浓度增高，根系磷质量分数显著减少、根际土壤有效磷质量分数增加，表明盐胁迫时根系对磷素的吸收被限制[57-58]；而高浓度盐时，接种摩西球囊霉的榉树，根系磷质量分数高于不接种丛枝菌根真菌、接种扭形球囊霉的根系磷质量分数，根际土壤有效磷质量分数低于不接种丛枝菌根真菌的根际土壤有效磷质量分数。根系生长量提高导致根际土壤养分含量减少，表明盐胁迫时，丛枝菌根真菌能通过增强根系对养分的吸收[59]，以优化根系形态。此外，本研究中，接种丛枝菌根真菌后，根系氮质量分数随盐浓度增加呈上升趋势，根际土壤氮质量分数同样增加。

谷胱甘肽还原酶、硝酸还原酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶的活性，反映着植物的生理状态[60]。硝酸还原酶对氮代谢起关键作用，其活性可反映植株的氮素水平[61]。硝酸还原酶活性的提高能促进植物体内的氮代谢过程[62]，而盐胁迫会抑制植株硝酸还原酶活性[63]。本研究中，接种摩西球囊霉，硝酸还原酶活性随盐浓度升高呈现下降趋势，与接种扭形球囊霉相反；而由于菌株与植物亲和力差异性的存在，导致丛枝菌根真菌对硝酸还原酶活性的影响发生差异。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性与植物氧化还原反应联系紧密，参与细胞代谢的调控[64]。高浓度盐时，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性显著降低，而接种丛枝菌根真菌显著提高了植株根系烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶的活性；表明丛枝菌根真菌能通过提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化酶活性，消除植物细胞内氧毒性[65]，以提高植物耐盐性。谷胱甘肽还原酶是衡量胁迫时植物状况的生理指标，在植物抵御干旱、低温、盐等非生物胁迫中扮演重要角色[66]，本研究中，谷胱甘肽还原酶活性在各处理间差异均不显著，原因在于谷胱甘肽还原酶活性根据物种、品种和胁迫类型不同而发生变化。

综上，本研究结果表明，盐胁迫对榉树根系形态、根系养分质量分数、根系生理特征、根际土壤养分均有抑制作用；接种丛枝菌根真菌，能优化植物根系形态，改善植物根际土壤环境，促进根系养分吸收，调节植株酶活性，从而缓解盐胁迫对植物的危害，提高植物对于高浓度盐胁迫的耐受度。