FHV-1阳性猫角膜腐骨病不同手术方式治疗效果的比较

毕静文，达举云，史金莲，张 勇

(甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070)

近年来宠物医疗行业中，猫病的比例逐渐增加，猫眼科疾病也越来越受到人们的关注。猫角膜腐骨病(feline corneal sequestrum)又称坏死性角膜炎，绝大部分病例的腐骨片发生在角膜上皮层和基质层，多是黑棕色。猫疱疹病毒1型(Feline herpesvirus-1，FHV-1)被认为是引起猫角膜腐骨病的主要病毒之一。目前猫角膜腐骨病的治疗在前期可用药物点眼保守治疗，腐骨片有一定概率自行脱落，手术治疗最常用的方式是带蒂结膜瓣遮盖术，此外还有自体角膜结膜板层移植术(lamellar keratoplasty,LKP)，以及生物补片修补术。目前在异种角膜移植方面也取得了一定的进展，Ven Hippel、Amano S等在兔、猪角膜板层移植获得了成功[1]，后续也有许多学者对异种角膜移植进行了研究，但宠物临床上还没有得到应用。本试验对FHV-1阳性角膜腐骨病的患猫进行了不同手术方式的治疗并尝试使用了新型植片，对比治疗效果，为临床治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样本 本试验选取2019年-2021年间成都眼专科动物医院经临床诊断为角膜腐骨病的患猫90例，并采集眼鼻口拭子共90份。

1.1.2 主要耗材 生物补片(Vetrix BioSIS)，美国库克生物技术公司(Cook Biotech incorporated )产品；SA缝线(USP8-0、USP3-0)，古氏贸易(上海)有限公司产品。

1.1.3 主要药品 聚维酮碘(100 g/L)山东安捷高科消毒科技有限公司；妥布霉素滴眼液(3 g/L 5 mL∶15 mg)s.a.ALCON-COUVREUR n.v.；重组人表皮生长因子衍生物滴眼液(15 000 IU/3 mL/支)深圳市华生元基因工程发展有限公司；更昔洛韦滴眼液(8 mL∶18 mg)湖北远大天天明制药有限公司；重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液(21 000 IU/5 mL)珠海亿盛生物制药有限公司；硫酸新霉素眼膏(5 g/支)APEX公司；他克莫司滴眼液(1 g/L 5 mL∶5 mg以他克莫司计)Senju Pharmaceutical Co.,Ltd。

1.1.4 主要仪器 离心机(5417)德国Eppendorf公司产品；PCR扩增仪(YK1125511)BIO-RAD公司产品；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(DP315)天根生化科技北京有限公司产品；电泳仪(DYY-6C)北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 PCR检测 将90份猫眼鼻口拭子样本在无菌条件下用生理盐水悬浮振荡,1 000 r/min离心10 min取上清液作为模板，应用天根生物DNA提取盒提取DNA，按说明书步骤进行提取。引物选择如表1所示。用PCR扩增仪进行扩增，将得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察所得到的条带。并将阳性样本应用市售免疫荧光层析试纸进行检验性检测。对阳性结果患猫进行治疗。

表1 引物选择Table 1 Primer selection

1.2.2 手术治疗 26例病例术前检查评估均符合手术标准，且FHV-1 PCR检测及市售免疫荧光层析试纸检测均为阳性。其中9例施行结膜瓣遮盖术、9例施行自体角膜结膜板层移植术、8例施行生物补片修补术。术前禁食6 h，禁水2 h。

所有病例术前均进行镇静止痛，吸入式维持麻醉。仰卧保定，用眼科手术固定枕固定头部，对术眼的眼周进行备皮，用1 g/L聚维酮碘冲洗眼部及周围组织，后立即用无菌生理盐水冲洗干净，反复3次以清理角膜表面分泌物并达到消毒的目的。

1.2.2.1 结膜瓣遮盖术 将角膜腐骨部位完全剔除，在最靠近角膜损伤的一侧，用眼科无齿镊伸至结膜穹隆处，提起球结膜，用眼科手术剪剪取合适大小的带蒂结膜瓣，需能覆盖全部损伤部位，并用眼科手术剪修剪结膜瓣至最薄程度。将带蒂结膜瓣拉起覆盖住角膜损伤部位，采用8-0眼科缝合线进行连续褥式缝合。

1.2.2.2 自体角膜结膜板层移植术 清除全部腐骨片，在靠近病灶部位的健康角膜上做梯型板层切开，剥离至角巩膜缘延续至球结膜处，分离出适合大小的结膜，制成角膜结膜移植瓣，再将角膜结膜移植瓣牵拉至移植床，修剪角膜瓣边缘，使其与移植床完全贴合[2]。应用古氏SA USP8-0缝线将角膜结膜移植瓣与简单连续缝合至移植床上。

1.2.2.3 生物补片修补术 清除全部腐骨片，剪取合适大小的生物补片，用古氏SA USP8-0缝线进行结节缝合。

1.2.2.4 第三眼睑遮盖术 所有病例均联合第三眼睑遮盖术，第三眼睑遮盖术可以减少缝线的机械性摩擦。截取一段0.5 mm左右的无菌头皮针的塑料软管备用，用眼科无齿镊轻轻提起第三眼睑，在第三眼睑一端进行纽扣缝合。用PGA2-0缝线，先由内向外，再由外向内穿透第三眼睑，再将两线末端分别从上眼睑外侧结膜穹窿穿出[3]。将缝线穿过准备好的塑料软管，暂不打结，按照同样的方法作第二道纽扣状缝合。最后收紧缝线打结，使第三眼睑遮盖整个眼球。

1.2.2.5 异种角膜移植术 首先制备湿房保存液。10 mL生理盐水中加入妥布霉素滴眼液2 mL和他克莫司滴眼液2 mL制成湿房保存液。湿房保存液是较易获取且廉价的角膜短期保存液，本试验采用并改良自20世纪30年代沿用至今的4℃湿房保存眼球法，该方法由前苏联医生Filotov首创[4]。摘取新鲜兔眼，用1 g/L聚维酮碘和生理盐水冲洗后立即放入提前配置好的含有他克莫司和妥布霉素的湿房保存液中，置-4℃保存。移植手术在2 h～4 h内进行。用眼科镊夹住球结膜固定患猫眼球，应用角膜板层刀清除腐骨片，从湿房保存液中取出兔眼球，用板层刀延巩膜边缘取出不含弹力层及内皮层的兔角膜片，制成兔角膜板层植片，修剪至合适移植床的大小，将兔角膜植片覆盖在角膜缺损部位，避免用有齿镊钳夹损伤植片，应用古氏SA缝线 USP8-0进行连续缝合。植片移植完成后施行第三眼睑遮盖术。

2 结果

2.1 PCR检测结果

90例角膜腐骨患猫PCR检测结果为26例阳性，市售免疫层析试纸重复检测均为FHV-1阳性。

2.2 手术治疗结果

图1为结膜瓣遮盖术手术过程，图1中A、B、C为清除角膜腐骨部分裸露的移植床，图1中a、b、c为施行结膜瓣遮盖术。图2为LKP手术过程，图2中A、B、C为清除角膜腐骨部分裸露的移植床，图2中a、b、c为施行LKP手术。图3为生物补片修补术过程，其中A为角膜腐骨清除，B为应用生物补片修补角膜术后。图4为施行第三眼睑遮盖术，所有病例均联合了第三眼睑遮盖术。

所有病例24 h佩戴伊丽莎白圈，每日眼药水滴眼。妥布霉素滴眼液每日4次，更昔洛韦滴眼液每日6次，重组牛碱性成纤维细胞生长因子滴眼液每日6次，重组人表皮生长因子衍生物滴眼液每日6次，硫酸新霉素眼膏每日2次。异种角膜移植术后增加他克莫司滴眼液每日2次。他克莫司滴眼液主要成份为他克莫司，是一种新型免疫抑制剂主要抑制钙调磷酸酶，可阻断T淋巴细胞的激活，适用于预防器官移植的排斥反应[5]。糖皮质激素虽然也可以抑制排异反应，但会引起角膜溃疡面难以愈合甚至病情加重，副作用大且会引起一系列并发症[6]。结膜瓣遮盖术术前及术后1个月对比如图5所示。自体角膜结膜板层移植术术前及术后1个月对比如图6所示。生物补片修补术术前及术后1个月对比如图7所示。结果显示生物补片修补术预后效果优于自体角膜结膜板层移植术以及结膜瓣遮盖术术后1周拆除第三眼睑遮盖，角膜血管爬行速度比正常情况快1倍以上，角膜透明程度良好如图8中A所示。术后3周角膜基本恢复透明，预后良好，治疗周期比传统手术方式有所收短，如图8中B所示。无明显排异反应，术后第1周～2周内偶有轻微咳嗽，不排除与气管插管导致的摩擦有关，尚无法证实其与排异反应的关联。

A、B、C.角膜腐骨清除术 ；a、b、c.结膜瓣遮盖术A,B,C.Corneal rotting bone removal surgery;a,b,c.Conjunctival flap covering surgery图1 角膜腐骨清除术及结膜瓣遮盖术Fig.1 Corneal rotting bone removal surgery and conjunctival flap covering surgery

A、B、C.角膜腐骨清除术 ；a、b、c.LKP手术A,B,C.Corneal rotting bone removal surgery;a,b,c.Autologous corneal conjunctival lamellar transplantation surgery图2 角膜腐骨清除术及LKP手术Fig.2 Corneal rotting bone removal surgery and autologous corneal conjunctival lamellar transplantation surgery

A.角膜腐骨清除术；B.生物补片修补术A.Corneal rotting bone removal surgery;B.Biological mesh repair transplantation surgery图3 角膜腐骨清除术及生物补片修补术Fig.3 Corneal rotting bone removal surgery and biological mesh repair transplantation surgery

A.塑料软管；B.第三眼睑A.Plastic tube;B.Third eyelid图4 第三眼睑遮盖术Fig.4 Third eyelid covering

A、B、C.结膜瓣遮盖术术前 ；a、b、c.结膜瓣遮盖术术后A,B,C.Preoperation of conjunctival flap covering surgery;a,b,c.Postoperation of conjunctival flap covering surgery图5 结膜瓣遮盖术术前及术后对比Fig.5 Preoperation and postoperation of conjunctival flap covering surgery

A、B、C.自体角膜结膜板层移植术术前；a、b、c.自体角膜结膜板层移植术术后A,B,C.Preoperation of corneal conjunctival lamellar autograft;a,b,c.Postoperation of corneal conjunctival lamellar autograft图6 自体角膜结膜板层移植术术前及术后对比Fig.6 Preoperation and postoperation of corneal conjunctival lamellar autograft

A.生物补片修补术术前；B.生物补片修补术后恢复情况A.Before biological patch repair operation;B.1 month after surgery recovery of biological patch repair图7 生物补片修补术术前及术后对比Fig.7 Comparison before and after biological patch repair operation

A.术后1周拆除第三眼睑遮盖；B.术后3周角膜恢复情况A.Removal of the third eyelid occlusion 1 week after surgery;B.Corneal recovery 3 weeks after surgery图8 术后角膜恢复情况Fig.8 Corneal recovery

3 讨论

针对不同手术方式来说，每种手术方式优缺点如下：生物补片修补术预后角膜透明度更高，但价格高昂，且目前无动物临床专用的生物补片。结膜瓣遮盖术价格低廉但术后恢复时间较前两种手术方式长，由于结膜本身不具有透明性，术后角膜透明性恢复较差；LKP透明度较结膜瓣手术要好，但术后角膜巩缘会在视轴上留下痕迹，影响动物视力。

在兽医临床上同种异体角膜移植的效果目前还未有明确研究，其局限性在于供体稀缺。异种角膜板层移植方式在一定程度上弥补了这一缺陷。猫的角膜大致分为4层，即上皮层、基质层、后弹力层和内皮层，其中90%约为基质层[7]。角膜板层移植的术式分为前板层移植、中板层移植及后板层移植[8]。目前在兽医临床上所致的一般为角膜前板层移植，只移植上皮层以及部分基质层，保留后弹力层及内皮层。异种角膜板层移植取得进展的原因主要在于角膜不含淋巴管及血管，本身免疫排斥发生的概率略低且角膜排异反应主要针对内皮层，对基质层反应较轻微。M Teresa Pea Gimenez等在1998年就做了相关研究，将犬角膜板层植片移植到猫角膜植床，研究也表明了猫对于基质组织的免疫识别较低[9]。异种角膜移植研究取得进展还有一层原因是猫的血管化倾向低，刺激新生血管快速生成可缩短角膜愈合时间，初步猜想是兔角膜植片以及缝线和伤口激活了血管内皮源性生长因子(vascular endothe-lial-derived growth factor,VEGF)，VEGF被认为在新生血管的过程中起着至关重要的作用且是伤口修复的中心介质，还可以下调免疫机制[10]。这一猜想还需进一步验证，异种角膜移植方式治疗猫角膜腐骨还需大量试验验证及优化异体角膜植片处理方式和手术方式。