西番莲花粉活力研究初报

陈 媚，冯红玉，徐 丽，刘迪发，姚碧娇，符小琴，高 玲

[中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业农村部植物新品种测试(儋州)分中心，海南儋州，571737]

全球西番莲属植物约有520个种，它们在形态、农艺性状等方面都存在较为丰富的差异，其遗传多样性研究与应用起步较晚[1]。1988年，我国开始广泛引进并种植西番莲，但品种较为单一，遗传基础狭窄[2]，育种与规模化种植受到限制。实际生产中，西番莲种质资源保护和新品种培育尤为重要。

西番莲属植物大多数属于二倍体(Passifloraedulis，2n=2x=18))，是典型两性花植物，但雌蕊和雄蕊发育时间不一致，自花授粉结果率较低，异花授粉为提高其遗传多样性和杂交育种提供了条件。

国外西番莲的杂交育种较为活跃，尤其是观赏西番莲的种间杂交，而我国西番莲资源评价与育种起步较晚。芽变是一种简易而又有效的选育新品种的方法，但因芽变常源于芽端体细胞的突变，变异常限于个别基因的表型效应，故芽变育种在变异范围和幅度上存在一定局限性[3]，仅适于现有品种的修缮和改良，原始创新的突破则需开展杂交育种。

近年，我国西番莲种内杂交、种间杂交工作取得一定进展。花粉是植物的雄配子体，是开花植物遗传信息的载体和交流工具，是植物有性繁殖过程所必需的材料[4]。父本具有良好的花粉活力是成功进行杂交育种的重要条件[5]。不同品种或不同种的花粉特性不同，熟悉其花粉特性可以提高种质创制与杂交育种的效率。因而，检测西番莲属花粉活力可以提前预知花粉发芽可靠程度，对提高繁殖效率和实施杂交育种具有非常重要的意义。

阻抗流式细胞仪法(IFC)是一种利用阻抗流式细胞仪，无需染色，实时不间断检测单个细胞在电场中的阻抗，以点图显示活性花粉百分比率的方法，具有可靠、快速、无破坏性等优点[6-7]，目前榛子、小麦、玉米等作物上均有应用[8-10]。本文使用IFC测定比较部分西番莲品种花粉活力，为授粉和花粉收集保存提供参考，从而为西番莲杂交育种和种质资源创新提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

2020年12月16—19日和2021年3月24—26日分别开展试验，小黄金1号Passifloraedulis×P.edulisf.Flavicarpa、大黄金1号Passifloraedulis×P.edulisf.Flavicarpa、台农P.edulisf.Flavicarpa×P.edulis、满天星P.edulisf.Flavicarpa×P.edulis、红花西番莲P.miniataVanderplank和紫花西番莲Passiflora×violaceaVell.等6个西番莲品种，来自中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所十队基地西番莲种质资源保存圃。

1.2 仪器

花粉活力分析仪Ampha Z30-Pollen Analyzer，瑞士Amphasys公司产。

1.3 方法

1.3.1 样品的采集 选取发育正常，当天即将开花的花朵，从开放前开始取样，约2 h取样1次，每次用镊子取同朵花上花药1粒放入1.5 mL离心管中备用。

1.3.2 花粉活力测定 用移液枪移取缓冲Buffer 0.75 mL至装有花药的离心管中，通过震荡、轻弹或放入试管架快速拨动离心管使花粉分散悬浮于缓冲液中；使用孔径100 μm过滤塞将花粉悬浮液过滤到5 mL样品管中，再次移取Buffer 0.75 mL冲洗离心管，并将冲洗液过滤到样品管中，得到待测花粉悬浮液；花粉悬浮液静止平衡2～3 min，重新翻转混匀后立即上样测试；测试得到象限散点图，通常散点图分为两个明显类群，当出现1个类群时，需要同规格失活对照确定类群的状态，通过失活对照准确区分测试样品的活性类群及失活类群。

1.4 数据分析

通过定义坐标轴“Phase”(花粉相对活性)及“Ampl”(花粉相对大小)范围调整象限散点图到最佳效果；统一测试样品坐标轴，并根据散点图分布情况设置门控，门控左侧为失活花粉粒比例，右侧为活性花粉粒比例。

2 结果与分析

2.1 花粉活力动态变化分析

小黄金1号大致开花时间为11：00—13：00，闭合时间为18：00以后。由图1可知，小黄金1号在开花散粉前至花朵闭合前花粉活力均较强，活性花粉比例均达到了80%以上，测试时间活性花粉比例分别为86.88%、88.30%、94.19%、94.96%和87.13%，其中花粉活力12：00—15：00最强。

图1 不同时间小黄金1号西番莲失活和活性花粉比较

大黄金1号开花时间为14：00左右，为取样方便，从第一次取样开始，将待采花粉花蕾枝条带回实验室用自来水浸泡防止其缺水。由图2可知，从08：47起至次日15：11，大黄金1号活性花粉比例分别为51.40%、83.59%、8.18%、39.23%、14.44%。花粉活力从12：54起骤降，为验证其原因，于次日14：16起，每隔15 min按原取样方法再从室外取另1朵花的花粉进行测定，活性花粉比例分别为88.5%、91.75%、91.72%、95.51%，远远高于前1天同期测定的花粉活力，初步推测大黄金1号花粉活力对环境较为敏感，置于室内时间过长可能导致花粉活力严重下降。同时也不排除同朵花个别花药发育成熟度低或发育缺陷(如活性花药比例8.18%所采用的花药)。

图2 不同时间大黄金1号西番莲失活和活性花粉比较

台农花朵上午未开放前便开始散粉，并且花粉活力一直保持80%以上高活性，直到18：00后，花朵将闭合前花粉活力迅速降低。经观察，台农花朵集中开放时间为11：30左右。由图3可知，不同时间活性花粉比例分别为86.67%、86.44%、87.85%、86.49%、86.95%、40.5%。

图3 不同时间台农西番莲失活和活性花粉比较

由图4可知，满天星一天的花粉活力明显呈现先上升后下降的趋势，13：00花朵开放前后达到最大值。08：24花药未散粉，此时花粉活力最低，活性花粉比例为59.56%；10：25活性花粉比例为70.66%；12：21和13：17这两个时间点的活性花粉比例较高，分别为87.86%、85.25%；14：28活性花粉比例为82.36%；15：23花粉活力开始明显下降，此时活性花粉比例为62.76%。

图4 不同时间满天星西番莲失活和活性花粉比较

红花西番莲通常凌晨开花夜晚闭合。取样时，第二天将开放的花蕾于前一天17：40取花粉进行测定，后面采样为次日08：00后进行，此时花已完全开放。由图5可知，红花西番莲花粉活力呈现先下降后上升再下降的趋势，10：19活性花粉比例最小，只有38.26%；13：15活性花粉比例最大，为81.77%；其他时间的活性花粉比例在50%～70%之间。

图5 不同时间红花西番莲失活和活性花粉比较

紫花西番莲开花时间在14：00左右，花朵完全开放1 h后开始散粉，花粉活力在开花当天始终极低，由图6可知，各时间点的活性花粉比例分别为2.7%、4.54%、5.14%、5.97%、6.01%。

图6 不同时间紫花西番莲失活和活性花粉比较

2.2 不同品种花粉活力比较

由表1可知，不同品种西番莲花粉活力不同。小黄金1号和台农活性花粉比例大于80%的时间最长，均为08：00—17：00，持续9 h；而满天星持续3 h，大黄金1号持续6 h；红花持续时间最短，仅1 h。整体上看，5个品种花粉活力峰值均在中午至下午出现，台农和满天星花粉活力最早达到峰值，时间均为12：00—13：00，其次为红花，再次为小黄金1号，大黄金1号最晚。黄果类西番莲活性花粉比例较高，小黄金1号为94.96%，大黄金1号比小黄金1号稍高，为95.51%，均达到了90%以上。紫果类西番莲花粉活性较黄果类稍低，台农和满天星的活性花粉最高比例分别为87.85%和87.86%，两者极为相近。红花作为观赏品种，花粉活力较低，活性花粉最高比例为81.77%。供试品种花粉活力衰减的速度也不一样，红花的花粉活力衰减速度最快，15：00以后活性花粉比例就已下降至53.20%；满天星在15：00以后活力花粉也衰减到了63.76%；小黄金1号花粉活力从16：00以后开始衰减，但此时的活性花粉比例仍高达87.13%；台农在18：00以后花粉活力出现明显衰减，低至40.50%。

表1 不同品种西番莲花粉活力比较

2.3 不同季节和不同环境的影响

分别于2020年12月16—19日和2021年3月24—26日测定了红花、小黄金、台农3个品种花粉活力，两个时段均为盛花期。从表2可知，2021年3月平均最高温度31.6 ℃，较2020年12月的平均最高温度22.2 ℃高9.4 ℃，而2021年3月平均最低温度也较2020年12月高4.7 ℃，两个月份的气温相差较大。红花西番莲2021年3月的花粉活性与2020年12月差异明显，2020年12月10：00至16：00左右活性花粉比例一直保持在85%以上，比2021年3月测定时间点的活性花粉比例都高。2021年3月，红花活性花粉比例在15：17便出现了急剧下降，而2020年12月的活性花粉比例在16：13仍保持87.02%。说明2020年12月红花西番莲花粉活力较2021年3月高。小黄金1号花粉活力在2021年春季和2020年冬季相邻时间段差异不明显；2021年春季的台农花粉活力稍高于2020年冬季，这反映了不同品种西番莲的花粉活力对温度变化的敏感性不同。

表2 不同季节不同品种西番莲花粉活力比较

2020年12月19日分别取简易网室和露地种植的红花西番莲测定花粉活力，由图7可知，露地种植的各时间点活性花粉比例均比网室种植高；露地种植的活性花粉比例80%左右，而网室种植的活性花粉比例70%及以下。网室种植的活性花粉比例呈现先降后升的趋势，9：00活性花粉比例最低，为62.28%，10：30达到最大，为70.01%；露地种植的活性花粉比例变化趋势一致，与网室不同的是出现了第二次下降的拐点，9：30活性花粉比列最低，为78.89%，8：30和10：00较高，分别为85.03%和85.01%。

图7 不同种植环境下红花西番莲活性花粉变化

3 结论与讨论

自然条件下，西番莲花粉寿命极短，常在花后第二天便失去活力，因而花粉采集与贮藏显得尤为重要。确定花粉最佳采集时期，保证花粉最佳成熟度，是决定贮藏花粉活力保持较高水平以及后续杂交育种成功的关键[11]。供试6个品种中，除紫花西番莲外，其他品种花粉活力均在花朵完全开放前后达到峰值，这就是花粉采集最佳时间。小黄金1号和大黄金1号活性花粉比例最高可达90%以上，分别为94.96%和95.51%。不同品种西番莲花粉发育进程不同，其活力的持续时间也不同。小黄金1号和台农花粉活力持续时间最长，08：00—17：00之间均保持80%以上的高活力，活性花粉比例80%以上的其他品种持续时间分别是大黄金1号6 h，满天星3 h，红花仅1 h。对于红花西番莲而言，适当低温有利于其保持较高的花粉活力；另外，露地种植环境下其花粉活力明显高于网室种植。

花粉活力主要受遗传因素影响，环境温度和相对湿度也是影响花粉活力的重要因子[12-13]。李凤荣[14]等指出，植物花粉在低温条件下可以保持较高的活力。本研究中，红花西番莲花粉活力2020年冬季明显比2021年春季高，而且活力持续时间更长，这与前人的研究结果一致；小黄金1号在这两个季节花粉活力未出现明显差异；台农2021年春季的花粉活力比2020年冬季略高，但差异不明显。这说明不同温度对不同品种西番莲花粉活力影响不同。此外，露地种植与网室种植的红花西番莲花粉活力差异明显，露地种植温度低、湿度高，网室种植温度高、湿度低，光照强度也不相同，这些可能是影响花粉活力不同的主要因素；也可能由于长期的露地种植使红花西番莲产生较强的抗逆能力，使其具有保持较高花粉活力的能力，有待于进一步研究。

本研究对当前西番莲主栽品种和观赏品种花粉收集时间和田间授粉实践有一定的参考价值；对不同季节花粉活力进行了比较，但花粉取自同朵花单个花药，同朵花中不同花药的花粉发育程度理论上最为相似，但每一批次开放的花朵个体间存在差异，营养条件也会影响花药发育质量，有待进一步验证。下一步研究中，将采集相同生育时期不同花朵花粉混合后测定，一方面增强花粉的代表性，另一方面增加测定时间点，增加至8～10个时间点，更好地探索部分材料出现二次拐点的原因。对于一些品种，如紫花西番莲在花朵开放当天花粉活力极低，花朵开放前后1 d甚至更长时间会出现活力峰值可作为今后研究方向。