液相色谱-质谱/质谱法法测定禽畜肉中氯霉素类兽药残留量

王文鹏，王 涛，王娜娜，李 丽

（延安市食品质量安全检验检测中心，陕西延安 716000）

酰胺醇类抗生素主要有氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考，其中氯霉素是其代表性药物，因此也常被称为氯霉素类抗生素。氯霉素对多数革兰阴性菌和革兰阳性菌都有抑制作用，抗菌谱广，价格相对低廉，常被用于禽畜产品、水产品的养殖过程中[1]。但由于其严重的毒副作用，近年来美国、欧盟及中国等已禁止应用于动物疾病防治，规定在动物源性食品中不得检出[2]。而其同类物甲砜霉素、氟苯尼考在《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中都有规定，其中甲砜霉素的ADI为 0～ 5 μg·kg-1，在牛、羊、猪、家禽和鱼的各种可食组织中最大残留量为50 μg·kg-1；氟苯尼考的 ADI为 0 ～ 3 μg·kg-1，在牛、羊的肌肉组织中最大残留量为200 μg·kg-1，在其肝脏组织中为3 000 μg·kg-1，在其他动物食品的不同组织中各有不同。氟苯尼考胺作为氟苯尼考主要的代谢产物，其最大残留量要计入氟苯尼考[3]。但目前其检测标准不同，且同时测定食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的方法较少[4-6]。本文参考相关标准和文献建立了一种同时测定4种酰氨醇类抗生素的方法[7-10]。

1 材料与方法

1.1 材料

猪肉、鸡肉、牛肉，采购自市场。取肌肉组织将其切碎，充分混匀，直接放入组织捣碎机中捣碎成匀浆，放入聚乙烯瓶中，-18 ℃冷冻保存。

1.2 试剂

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺和氯霉素 -D5（100 μg·mL-1）（由坛墨质检提供）；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵（色谱纯，默克试剂）；无水硫酸镁、无水乙酸钠（分析纯，国药试剂）；所用氮气、氩气浓度大于99.99%。

1.3 仪器与设备

LCMS8040三重四极杆液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI源），日本岛津；离心机：转速≥10 000 r·min-1，Sigama；涡旋混合器：IKA；电子天平（感量为0.001 g）：梅特勒；氮吹浓缩仪：莱伯泰科；具塞离心管：50 mL和15 mL，康宁。

1.4 试样的制备及方法

1.4.1 试样制备

称取解冻后试样5 g（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加 100 µL 氯霉素 -D5 内标（0.1 µg·mL-1）工作液和15 mL 2%氨水乙腈溶液，涡旋振荡15 min，超声提取 15 min，8 000 r·min-1离心 5 min。将上清液移入100 mL分液漏斗中，加15 mL乙腈饱和的正己烷脱脂。残渣中再加入10 mL 2%氨水乙腈溶液，重复一次，取上清液转移至同一分液漏斗。转移乙腈层至50 mL离心管中，离心，取上层清液，氮气吹干。加入1 mL水，振荡2 min，超声3 min复溶，取下层过0.22 μm微孔滤膜，供超高效液相色谱-串联质谱测定。空白基质的制备与样品制备过程相同。

1.4.2 标准溶液的配制

分别精密量取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺 4 种标准溶液（100 μg·mL-1）各 0.2 mL，置于同一20 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度均为1 μg·mL-1的混合标准中间液，精密量取1 mL内标中间液于10 mL容量瓶，用甲醇稀释成100 ng·mL-1的混合标准使用液。

精密量取氯霉素 -D5 标准溶液（100 μg·mL-1）0.2 mL，置于另一20 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度均为1 μg·mL-1的内标中间液，精密量取1 mL内标中间液于10 mL容量瓶，用甲醇稀释成100 ng·mL-1的内标使用液。

取空白样品9份，按照1.4.1的处理过程，在氮气吹干之前加入适量标准使用液和100 µL氯霉素-D5内标（100 ng·mL-1），用1 mL 10%甲醇水复溶，制成 0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和 200.0 ng·mL-1系列浓度，含内标 10.0 ng·mL-1。

1.5 仪器条件

1.5.1 参考液相色谱条件

色谱柱：C18柱[150 mm×2.1 mm（内径），1.7 μm]，菲罗门（Phenomenex）；流动相：A-甲醇；B-水溶液；梯度洗脱程序见表1；柱温箱：40 ℃；进样量：10 μL；流速：0.30 mL·min-1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI），其中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氯霉素-D5为负模式，氟苯尼考胺为正模式；离子源接口电压：4.5 kV；雾化气：氮气 2.0 L·min-1；干燥气：氮气 15 L·min-1；碰撞气：氩气；DL温度：250 ℃；加热模块温度：400 ℃；扫描模式：多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；驻留时间：100 ms；延迟时间：3 ms。MRM参数见表2。

表2 4种氯霉素类药物和内标化合物的保留时间、定量离子对、定性离子对

2 结果与分析

2.1 条件优化与选择

动物源食品中氯霉素的检测，主要有气相色谱-质谱和液相色谱-质谱两种检测方法，文献中同时检测氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺多种药物的方法一般是液相色谱-质谱法，大部分是检测其中2～3种[4-6]。通过测试，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺需要用内标法定量，因其样品的制备过程中损失较多，这与文献报道基本一致[7-9]。本研究比较了乙酸乙酯和乙腈等多种提取手段，发现乙酸乙酯提取脂肪较多，而2%氨水乙腈提取效果较好，能满足实验要求。文献中常用流动相为乙腈-水体系或甲醇-水体系[9-10]，也有添加氨水的文献报道[7]，经过测试，甲醇和水的体系就能达到较好的分离效果，因此本文选用甲醇-水体系，和现行有效国家标准一致。

2.2 线性关系与检出限

以各组分的定量离子峰面积与氯霉素-D5内标峰面积的比例为纵坐标（y），相应的质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，绘制标准曲线。结果表明，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺在0.5～200.0 ng·mL-1有良好的线性关系，相关系数均大于0.995，线性方程和相关系数见表3。取牛肉阴性样品，添加0.1 mg·kg-1混合标准溶液，加入标准混合液，以3倍信噪比法计算的检出限在0.022～0.120 μg·kg-1。

表3 4种氯霉素类药物的线性关系

2.3 加标回收率和重复性

取牛肉阴性样品，添加 0.1 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、10.0 mg·kg-13个浓度水平的混合标准溶液，进行加标回收试验，其余操作同1.4.1样品制备，每个浓度平均测定6次，计算回收率和重现性（以相对标准偏差表示）。结果显示，样品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的平均回收率在88.45%～112.45%，相对标准偏差RSD为1.86%～8.04%，具体结果见表4。结果表明,该方法回收率高、稳定性好，适用于牛肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的测定。同时对猪肉和鸡肉测试，得到相似的结论。

表4 3个添加水平上回收率和相对标准偏差

3 结论

本研究通过对牛肉、鸡肉和猪肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的分析测试，建立了高效液相色谱-串联质谱法同时测定食品中禽畜肉中4种氯霉素类药物残留的方法，并从线性关系、回收率、重复性和检出限等方面进行了考察。结果表明，该方法快捷、简便、回收率高，可用于禽畜肉中4种氯霉素类药物及其代谢物的测定，为研究同时测定动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的残留提供了参考依据。