布氏乳杆菌L34-2对黄曲霉毒素脱毒条件优化

王俊丽，陈春喜，邓展瑞

（1.甘肃省产品质量监督检验研究院，甘肃兰州 730050；2.兰州交通大学，甘肃兰州 730070）

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一类强致癌、致畸形的真菌毒素，它主要是黄曲霉（A.flavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）次级代谢产生的二氢呋喃氧杂萘邻酮衍生物，其致癌特性的来源是香豆素结构，毒性来源是二氢呋喃环结构[1]。已分离鉴定的黄曲霉毒素有 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2等18种，其中黄曲霉毒素B1（ Aflatoxin B1，AFB1）是已发现的AFT中毒性及致癌性最强的，1993年国际癌症研究机构（IARC）将AFB1划分为I类致癌物[2]。AFB1对肝脏及免疫系统有强抑制性，对人畜有很强的致癌、致突变、致畸性[3-4]。

目前，食品中常用的AFB1脱毒方法有物理法、化学法、生物法及基因干预4种方法。生物法去除AFB1效率最高、特异性最强、污染最小[5]。生物利用本身特异性结构或代谢产物吸附、修饰、破坏AFB1毒性分子结构，达到脱毒的效果[6-7]。本研究团队从35份采集自甘肃省不同地域的西北酸菜样品中筛选到一株AFB1吸附率高达66.4%的布氏乳杆菌L34-2，该菌株解吸后仍保留53.7%的吸附率。本研究通过正交试验优化菌株L34-2的脱毒条件，提高菌株吸附率、稳定性，同时对脱毒机理进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株来源

研究团队从西北酸菜中分离筛选到一株布式乳杆菌（Lactobacillus buchneri）L34-2，菌株 L34-2优化前AFB1脱毒率为66.4%。

1.1.2 试剂

（1）基础培养基。MRS培养基（CM188）、莫匹罗星锂盐（P-109）、半胱氨酸盐酸盐（P-03）、MC培养基（CM156）、磷酸盐缓冲液（CM1022）、营养琼脂（CM107）、马铃薯葡萄糖琼脂（CM123）、马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（CM123A）、缓冲蛋白胨水（CM201），以上培养基均由北京陆桥提供。

（2）HPLC-MS/MS试剂。二氯甲烷（色谱纯，sigma）；甲醇（色谱纯，sigma）；乙腈（色谱纯，sigma）；苯（色谱纯，sigma）。

（3）酶类。鸡卵白自溶酶（Sigma，USA）；蛋白酶（Sigma，USA）。

1.2 仪器设备

1300 SERLES A2-1379型生物安全柜，赛默白世尔（苏州）仪器有限公司；QTRAP 4500超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱联用仪，SCIEX；16-09405恒温鼓风干燥箱，BINDER。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理方法

发酵液经12 000 r·min-1离心15 min分离，上清液经0.22 μm滤膜过滤后过免疫亲和柱，用超纯水洗滤2遍，然后用甲醇（色谱纯）洗脱，收集洗脱液。

1.3.2 超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱联用仪条件

液相色谱：色谱柱（C18柱，100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱箱温度：40 ℃；流动相（乙酸铵/甲醇）；质谱条件：电离方式：电喷雾电离（ESI+）；检测方式：多反应监测模式（MRM）；气帘气（CUR）：35 psi；碰撞气（CAD）：medium；离子化电压（IS）：5 500 V；离子源温度：550 ℃；喷雾气（GSI）：55 psi；辅助加热器（GS2）：60 psi[8]。

1.4 单因素对菌株脱毒效率的影响

1.4.1 发酵温度对AFB1脱毒率的影响

参考WANG等[9]研究温度对AFB1生物脱毒率的影响，制备109CFU·mL-1菌悬液，氧气供应量100%，以30 mL/300 mL比例接种于AFB1浓度为10 ng·mL-1的发酵液中，发酵温度分别为25 ℃、28 ℃、30 ℃、34 ℃、36 ℃和 40 ℃，200 r·min-1振荡培养，研究发酵温度对菌株AFB1脱毒率的影响，得到适宜菌株脱毒的温度范围。

1.4.2 相同浓度菌悬液不同比例接种对AFB1脱毒率的影响

制备109CFU·mL-1菌悬液，氧气供应量100%，发酵温度为36 ℃，不同比例接种，分别为0 mL/300 mL、40 mL/300 mL、50 mL/300 mL、60 mL/300 mL 和75 mL/300 mL，200 r·min-1振荡培养，研究接种比例对AFB1脱毒率的影响，得到菌株最适宜的接种比例范围。

1.4.3 氧气浓度对AFB1脱毒率的影响

制备109CFU·mL-1菌悬液，发酵温度为36℃，接种比例为30 mL/300 mL，在培养过程中控制氧气的浓度为0%、20%、50%、75%和100%，测定氧气浓度对菌株AFB1脱毒率的影响，得到菌株发酵最佳氧气供应量范围。

1.4.4 发酵液pH值对AFB1脱毒率的影响。

结合SHU等[10]的研究发现pH值对AFB1生物脱毒率有影响，制备109CFU·mL-1菌悬液，发酵温度为36 ℃，接种比例为30 mL/300 mL，氧气供应量为100%，控制发酵液pH值分别为4.5、5.5、6.5、7.5和8.5，研究发酵液pH值对菌株AFB1脱毒率的影响，优化菌株发酵液pH值。

1.5 菌株脱毒发酵条件优化

根据单因素实验结果筛选影响菌株脱毒率的因素范围，利用minitab软件设计L9(34)正交实验，从发酵温度、接种量比例、氧气浓度和发酵液pH值4个因素优化发酵培养条件，以菌株脱毒率为统计量，对结果进行统计学极差分析，得到菌株小规模发酵脱毒最优条件，提高菌株脱毒能力。各因素正交实验设计见表1。

表1 菌株发酵条件优化正交试验设计表

1.6 数据统计分析

实验重复3次，结果采用Excel及Minitab软件中数据分析进行统计学分析，数据间的显著性差异分析采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素发酵条件对L34-2菌株AFB1脱毒率的影响

2.1.1 发酵温度对L34-2菌株AFB1脱毒率的影响

发酵温度影响菌体的生长，单因素发酵条件选择培养温度在25～40 ℃，筛选菌株适宜的生长温度范围，提高菌株AFB1脱毒能力，菌株在30 ℃培养时，菌体生长量最高，AFB1脱毒能力较未优化活菌有较高增加，脱毒率为76.1%，如图1，将发酵温度列为正交实验影响因素。

图1 发酵温度对菌株AFB1吸附率的影响

2.1.2 接种比例对AFB1脱毒率的影响

单因素发酵条件选择接种比例在30 mL/300 mL～75 mL/300 mL，如图2，接种量为50 mL/300 mL，菌株接种发酵48 h，AFB1脱毒效率提高为77.6%，75 mL/300 mL接种量过于密集，菌株对AFB1的脱毒率不是随着接种量增加而增强。通过接种量的比较，选择能提高菌株脱毒率的接种比例为正交实验考虑的因素水平。

图2 接种比例对菌株L34-2 AFB1吸附率的影响

2.1.3 不同氧气浓度对菌株AFB1脱毒率的影响

根据研究布氏乳杆菌为兼性厌氧菌，如图3，单因素发酵条件选择氧气浓度0%～100%，筛选L34-2菌株发酵脱毒时最适宜氧气供应量。氧气供应量在50%时，菌株L34-2 AFB1脱毒率提高为78.4%。将氧气供应量作为正交试验的参考因素。

图3 氧气供应量对菌株L34-2 AFB1吸附率的影响

2.1.4 发酵液pH对菌株L34-2 AFB1脱毒率的影响

单因素发酵条件选择发酵液pH值4.5～8.5，如图4，筛选L34-2菌株脱毒率大幅提高的发酵液pH值范围。发酵液pH值在4.5时，菌株L34-2 AFB1脱毒率最高为80.5%，菌株L34-2生长及AFB1脱毒适宜pH值低的环境，将发酵液pH值作为正交试验考虑因素。

图4 发酵液pH值对菌株L34-2 AFB1吸附率的影响

2.2 正交试验菌株脱毒发酵条件优化

根据单因素实验选择对菌株脱毒率有较大提高的发酵温度、接种比例、氧气供应量和发酵pH值，设计4因素3水平的正交试验，选择菌株脱毒最适宜的条件。由表2知，菌株L34-2脱毒过程中影响AFB1脱毒率的单因素顺序为发酵温度（4.03）＞发酵液pH值（3.83）＞接种比例（3.57）＞氧气供应量（2.23）。结合各因素水平作用效果分析，选择优化后的菌株L34-2发酵脱毒条件为发酵温度30 ℃，控制发酵液pH值4.0，接种比例为50 mL/300 mL，氧气供应量60%，优化条件后，菌株L34-2脱毒率为87.5%，比优化前提高21.1%脱毒率。

表2 正交实验优化菌株脱毒条件极差分析表

3 结论与讨论

布氏乳杆菌L34-2脱毒的最优条件为发酵温度30 ℃，发酵液pH值4.0，接种比例为50 mL/300 mL，氧气供应量60%，优化后菌株脱毒率提高到87.5%，比优化前提高21.1%。依据正交实验极差统计分析结果，发酵温度对菌株L34-2脱毒率影响最大。菌株L34-2对AFB1的脱毒主要是菌体对AFB1的吸附，吸附主要在细胞壁上进行，其中肽聚糖为主要吸附结构，胞外多糖为辅助吸附结构。关于吸附条件的优化，不同菌种有不同的要求，与邵帅等[11]研究优化降解黄曲霉素B1菌株发酵条件同样都优化发酵温度和接种比例，但增加发酵液pH值及供氧量，结果表明发酵液pH值及供氧量可显著提升菌株脱毒率。黄丽等[12]从中国传统乳制品中分离的C88植物乳杆菌胞外多糖对AFB1没有吸附作用，由于本研究菌种来源于西北特色酸菜中，筛选的功能菌的胞外多糖具有一定的吸附功能，这一点国内研究报道相对较少。以上所有关于专用菌种脱毒AFB1的研究，多处于实验室阶段，真正能用在国家大规模商品粮生物脱毒工艺的菌种以及脱毒条件，尚处空白。因此，工业化脱毒生物菌种以及脱毒条件未来应成为研究的重点方向。