萘乙酸在黄瓜中的残留及膳食摄入风险评估

许海康，臧娅磊，李 萌，李 通，周 娟，安 莉，马婧玮，宋 键，吴绪金*

(1.河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，河南 郑州 450002；2.郑州郑氏化工产品有限公司，河南 郑州 450002；3.商丘市实验中学，河南 商丘 476000)

黄瓜最初生长在热带雨林地区，是一年生蔓生植物[1]。富含纤维素、维生素以及各种矿物质，深受人们喜爱，已成为我国重要的蔬菜之一。萘乙酸化学名称为1-萘乙酸，英文通用名为Naphthylacetic acid，化学式是C12H10O2。萘乙酸是一种具有生长素类性质的植物生长调节剂，可以促进细胞分裂和扩大，诱导不定根的形成，促进植物的光合作用和新陈代谢，增加坐果率[2]。

目前，国内外关于萘乙酸的研究主要涉及萘乙酸的合成工艺[3]，对小鼠的毒性效应[4]，对植物扦插生根的影响[5-6]，增强油菜幼苗的抗逆性[7]，提高作物的产量与品质[8-12]，在苹果、柑橘等瓜果中的残留检测方法[13-14]。已报道萘乙酸的检测方法主要有紫外分光光度法[15]、高效液相色谱法[16]、气相色谱法[17]和高效液相色谱-串联质谱法[18-19]等，此外还出现了一些新型检测方法，如多壁碳纳米管增敏的电化学传感器检测法[20]、双水相萃取-流动注射化学发光法[21]等。孔德洋等[22]研究了以二氯甲烷为萃取溶剂，GPC(Gel Permeation Chromatography)净化，高效液相色谱分离，二极管阵列检测器测定水稻植株及土壤中萘乙酸的检测方法。牟艳莉等[23]报道了2%甲酸的乙腈溶液为提取剂，Poly-Sery MAX混合型阴离子交换固相萃取柱净化后，采用Phenomenex Gemini-NX 5uC18110A柱进行分离，用液相色谱-串联质谱法检测萘乙酸在橙中的残留量。胡晓科等[24]报道了萘乙酸在黄瓜、番茄中经QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)前处理，乙腈-二氯甲烷(1：1)提取，分散固相萃取法净化，超高效液相色谱法进行检测。José A.等[25]优化了荧光分光光度法，在测定草莓树浆果和柑橘类水果中的萘乙酸时，无需事先分离，更加快速、准确。

在黄瓜生长期间施用萘乙酸，有利于植株的生长发育，提高黄瓜产量。但关于萘乙酸在黄瓜中的残留分析和膳食摄入评估报道却很少。本试验采用QuEChERS前处理方法，HPLC-MS /MS对黄瓜中萘乙酸进行检测，开展萘乙酸在黄瓜中的残留对国人摄入风险进行评估，为萘乙酸在黄瓜上的科学合理使用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料 供试农药：10%吲哚丁酸·萘乙酸可溶液剂。

供试作物黄瓜，品种：内蒙古呼和浩特为德尔2012；辽宁辽阳为80-5；山西太原为17-8；天津宝坻为津优35号；山东济南为津春四号；河南郑州为黑优301；河北邢台为驰誉凤凰；上海松江为瑞新黑亮王；安徽合肥为中农2号；湖南长沙为津研7号；贵州贵阳为环农402；广西南宁为丰田黄瓜16号。

1.2 田间试验 试验时间2019年。按照农业农村部农药检定所发布的《农药登记残留试验区域指南》[26]选择试验地点，分别为内蒙古呼和浩特市、辽宁省辽阳市、山西省太原市、天津市、山东省济南市、河南省郑州市、河北省邢台市、上海市、安徽省合肥市、湖南省长沙市、贵州省贵阳市和广西省南宁市。按照《农作物中农药残留试验准则》[27]要求设置处理区和空白对照区，小区面积≥50m2，小区间设置隔离带。按照有效成分用量为10mg/kg，于黄瓜3～4叶期和初花期各喷雾施药1次，末次施药后3和5d采集黄瓜样品。

样本采集和制备：按照试验设计的采样时间要求，每次在每个小区黄瓜植株的不同部位至少采集12个黄瓜样品。每个小区均采集2个平行样品。将切碎后黄瓜样品充分混和均匀，各取2份150g样品，用干冰粉碎机把黄瓜样品粉碎，分别装入样品容器中，贴好标签，-20 ℃保存，待测。

1.3 检测方法

1.3.1 试剂和仪器设备 纯度为96.9%的萘乙酸标准品；色谱纯的乙腈和甲醇；色谱纯的甲酸和乙酸铵；分析纯的氯化钠和无水硫酸镁；ODS C18。

SCIEX QTRAP 4 500 高效液相色谱仪三重四级杆串联质谱仪；SQP电子天平(d=0.01g)、BS 224 S电子天平(d=0.1mg)；微乳剂 204E；Milli-Q Synthesis超纯水机；多管涡旋振荡器VX-Ⅲ；多管涡旋混合器UMV-2；L-550台式低速离心机；迷你离心机MLX-210；变速搅拌打碎机R10V.V。

1.3.2 溶液配制 精确称取0.010 2g的萘乙酸标准品，甲醇定容制成1 000mg/L的母液，甲醇作为稀释溶剂，稀释配制系列纯溶剂标准溶液5、2、1、0.5、0.2、0.1mg/L。按照1.3.4的操作步骤，得到黄瓜空白基质溶液作为稀释溶剂，配制系列基质标准溶液0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01mg/L。

1.3.3 检测条件 液相色谱柱：岛津 Shim-pack XR-ODSⅢ(2.0mm ×75mm，1.6μm)；柱温：40 ℃；流速：0.3mL/min；进样量：2μL；流动相梯度洗脱条件(表1)。电离方式：ESI-；离子源温度：500℃；雾化电压：5500V；雾化气体类型：空气；雾化气体压力：50psi；碰撞气体类型：氮气；检测方式：多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式下萘乙酸保留时间是4.33min，定性离子对是185/141m/z，定量离子对为185/141m/z，碰撞电压是14eV。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.3.4 样品处理 准确称取20.00g试验样品于50mL离心管中，加入10mL纯水，20mL乙腈，5g氯化钠，涡旋震荡提取20min，再4 000r/min离心10min，取1.5mL上清液装入含有0.03g无水硫酸镁和0.03gC18的2mL离心管中。涡旋1min，1 0000r/min离心5min，取上清液经0.22μm滤膜过滤后，待测。

1.3.5 方法有效性评价 将1.3.2配置好的黄瓜空白基质梯度萘乙酸标准溶液，以溶液质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制工作曲线，评价线性相关性及基质效应。通过在空白黄瓜样品中分别加入0.01、0.1、1mg/kg萘乙酸标准溶液，每个浓度均设置5个平行，分别计算回收率和相对标准偏差，用于评价正确度以及精密度。以最低添加浓度作为定量限。

1.4 膳食风险评估 以国家卫生行政部门发布的中国居民营养与健康状况监测调查为依据，结合萘乙酸残留化学评估推荐的规范残留试验中值、已制定的萘乙酸最大残留限量(maximum residue limits，MRLs)和急性参考剂量(acute reference dose，ARfD)，计算萘乙酸的国家估算每日摄入量(national estimated daily intake，NEDI)、每日允许摄入量(acceptable daily intake，ADI)、国家估计短期摄入量(national estimated short term intake，NESTI)以及占急性参考剂量的百分比(ARfD%)，计算公式见参考文献[28-33]。

2 结果与分析

2.1 方法有效性评价

2.1.1 线性相关性及定量限 将萘乙酸标准溶液用甲醇逐级稀释制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.5mg/L的标准溶液，以浓度(mg/L)—峰面积(A)作标准曲线，结果(表2)，决定系数R2=1.000 0，萘乙酸在0.01～0.5mg/L范围内在基质中呈现良好的线性关系。以添加回收试验中最小添加浓度为定量限，萘乙酸在黄瓜中的定量限为0.01mg/kg。

表2 萘乙酸的回归方程、决定系数、基质效应和定量限

2.1.2 基质效应 按照以下公式计算萘乙酸在黄瓜中的基质效应。

公式1

式中，微乳剂为基质效应；X基质为基质标样斜率；X溶剂为溶剂标样斜率

基质效应(Matrix Effect)评价标准：对纯溶剂与基质配制标准曲线的斜率进行比较，若基质效应的绝对值≥20%，则采用基质配制标准溶液制作标准曲线，绝对值<20%，则采用纯溶剂配制标准溶液制作标准曲线。按公式1计算出基质效应微乳剂=3.9%，微乳剂<±20%，表明基质效应较弱，因此本试验样品检测采用纯溶剂配制标准曲线。

2.1.3 添加回收试验 当添加水平为0.01、0.1和1mg/kg时，黄瓜中萘乙酸的平均回收率分别为99%、112%和104%，相对标准偏差分别为5.7%、4.9%和6.5%。方法正确度和精密度均符合《农作物中农药残留试验准则》要求。

2.2 最终残留试验 结果表明(表3)，采收间隔期为3d时，黄瓜中萘乙酸的平均残留量均<0.01mg/kg；采收间隔期为5d时，黄瓜中萘乙酸的平均残留量均<0.01mg/kg。目前GB 2763-2021规定黄瓜中萘乙酸的最大残留限量值为0.1mg/kg[34]。本试验中不同采收间隔的黄瓜样品中萘乙酸残留量均低于我国制定的限量标准。

表3 萘乙酸在12个试验点黄瓜中最终残留

2.3 膳食风险评估 结合萘乙酸在黄瓜中的最终残留量，运用膳食摄入风险评估模型进行萘乙酸在黄瓜上的急性膳食摄入和长期膳食摄入风险评估[37]。目前，萘乙酸在我国水稻、小麦等20种作物上已登记。根据中国健康与营养调查总结报告数据，将所有登记作物进行膳食分类[38]。萘乙酸ADI值是0.01mg/(kg·bw)，我国居民的平均体重为63kg。计算结果(表4和表5)，黄瓜中萘乙酸的国家估计短期摄入量是0.012 7mg/(kg·bw)，占急性参考剂量百分比是12.7%，萘乙酸使用后不存在急性膳食风险；普通人群萘乙酸的国家估算每日摄入量是0.053mg，占日允许摄入量的0.6%左右，结果表明对一般人群健康不会产生不可接受的风险。

表4 萘乙酸急性膳食摄入评估计算表

表5 萘乙酸长期膳食摄入评估计算表

3 讨论与结论

本研究建立了采用QuEChERS方法进行前处理、高效液相色谱-串联质谱法测定黄瓜中萘乙酸残留量的分析方法。该方法打破了传统的高效液相色谱法检测器种类少等检测样品的局限性，广泛应用于农药残留检测中，可以同时有效应用在多种植物生长调节剂在不同果蔬中的残留检测。前处理方法是检测农药在农产品中残留的关键步骤，QuEChERS方法作为一种创新型样品前处理技术，具有操作简便，快速，成本低和安全可靠等优点，此外QuEChERS方法也在应用中不断优化改进应用在不同果蔬中的农药残留检测[35-36]。在添加水平为0.01～1mg/kg时，萘乙酸在黄瓜中的平均添加回收率为99%～112%，相对标准偏差为4.9%～6.5%，具有良好的线性关系，回收率较好，精密度高，可适用于黄瓜中萘乙酸残留的定量分析。

萘乙酸在12地黄瓜样品中的残留量均<0.01mg/kg，对黄瓜中萘乙酸的膳食摄入风险进行评估，结果表明：10%吲哚丁酸·萘乙酸可溶液剂按照本研究的施药剂量、施药次数和采收间隔使用，黄瓜中萘乙酸的残留量对我国一般人群健康不会产生不可接受的风险。