不同冷冻程序对萨能奶山羊精液质量的影响

王广，李德娴，张永涛，邹家浩，李雪清，袁宇欣，余梦琦，陈璐，李广

（西北农林科技大学动物科技学院，奶羊产业技术创新实验室，杨凌 712100）

随着现代化畜牧业集约化发展，人工授精技术得到了广泛的应用。奶山羊精液冷冻保存有助于良种奶山羊精液长期保存留种和跨地域运输，有助于加速奶山羊产业发展进程，提高经济效益。然而，萨能奶山羊精液冷冻保存的研究存在解冻后精子活力低、受胎率低等问题。萨能奶山羊冷冻精液尚未广泛应用于生产。研究发现，精子在冷冻保存过程中，会因温度的变化受到不可逆的损伤，从而降低精子受精率。因此，筛选最适宜的奶山羊精液冷冻程序是非常有必要的。

众所周知，精液质量是影响人工受精效果的关键因素之一，而精液冷冻程序对于解冻后精液活率具有重要的影响。精子冻融后的存活主要取决于能否将细胞内冰晶形成减少到最低程度。理论上精子的冰点为-0.6℃，造成精子损害的温度为冰点至-60℃，精子进入冰点以下，就会形成冰晶，造成精子损害[1]。在-0.6～-10℃，由于甘油冷冻保护剂的作用，在冰点时可以快速通过，且对精液质量损伤较小。若使用快速的降温速率或者使用适当的冰冻冷冻剂，使精子迅速地跨过冰点至－60℃之间，可减少冰晶形成对精子的损害[1]。国内外研究表明，在危险区间内，人、牛和猪精液最佳降温速率分别为1～10/min、35℃/min和30℃/min[2～7]。目前尚未见到萨能奶山羊程序化冷冻的相关研究，因此，本试验利用不同冷冻程序，旨在找出萨能奶山羊冻精在危险区间内的最佳降温速率。

1 材料和方法

1.1 动物

本试验选用萨能奶山羊为试验动物。所用精液取自陕西省宝鸡市陇县和氏羊场2.5～3岁的6只萨能奶山羊，身体健康，性欲旺盛。体外人工受精所用母羊为平均年龄在1.8～2.5岁体况良好的萨能奶山羊，该试验在2021年4-12月期间进行。

1.2 采精

采用人工阴道法收集奶山羊精液。收集精液后，立即将其置于37℃保温杯中送往实验室，并在37～38℃下对精子样品进行精子密度和精子活力评估。精子形态正常，畸形率小于5%，精子活力在0.75以上，每毫升密度大于15亿的精液样本可用于后续试验。

1.3 精液处理

经显微镜检查的精液分为5个试验组（表1），对试验组A、B、C、D、E组进行不同冷冻程序处理，镜检精子活力后加入稀释Ⅰ液（乳糖46g/L、葡萄糖4g/L、柠檬酸钠15g/L），置于4℃冰箱2h。然后在4℃操作台中按照稀释Ⅱ液配方（Ⅰ液＋6%甘油）进行第二次等温稀释，在4℃冰箱中继续平衡1.5h，第二次平衡完成后，将精液注入0.25ml细管。根据5种不同程序将温度降至-140℃。精液温度下降至-140℃时即为冷冻结束，保持30s后立即取出细管浸入液氮中，完成冷冻过程[7]。冷冻1h后，将样品在38℃水浴中解冻40s，检测精子活力、质膜完好率、顶端体完整率。

表1 不同冷冻程序对精子活力的影响

1.4 精子评估

1.4.1 精子活力

精液样本通过计算机辅助精子分析（CASA）系统评估精子活力参数。测试了以下参数：总运动（TM）、渐进运动（PM）、平均路径速度（VAP）、直线速度（VSL）、曲线速度（VCL）、线性（LIN）、节拍交叉频率（BCF）。

1.4.2 精子质膜的功能

用超渗精子肿胀（HOST）方法测试质膜的完整性，首先将解冻的精液与低聚子果糖和柠檬酸钠溶液混合，在37℃下孵化60min。相差显微镜放大1 000倍观察样品。如果精子质膜完好，精子头部会吸水膨胀，尾部会膨胀卷曲[8]。通过一种特异性的荧光探针(异硫氰酸酯标记的花生凝集素、FITC-PNA)检测到顶体的完整性。具体的方法是：在37℃条件下，将解冻的精子样本与试剂盒中的ethD-1完全混合15min。将5μL混合物放入玻璃滑梯上，加入95%乙醇30s，然后加入15μL FITC-PNA溶液，在4℃反应30min，然后由PBS去除[9]。利用荧光显微镜（CX-31，日本东京奥林巴斯）在放大1 000倍下评估顶体完整性，在5个不同的区域评估200个精子。

1.5 体外受精和胚胎发育

1.5.1 卵母细胞的采集和培养

在屠宰场收获没有可见黄体的山羊卵巢，并置于添加抗生素的生理盐水中运输到实验室。收集的卵巢在无菌生理盐水中洗涤3次，在添加有10%胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水中洗涤2次。使用一次性注射器从中等大小的卵泡（直径3～6mm）中吸取卵母细胞。选择具有至少三层完整且致密的卵丘细胞和均匀颗粒状细胞质的卵丘-卵母细胞复合体(COC)在体视显微镜下进行体外培养至成熟。然后将COC在DPBS中洗涤3次，在成熟培养基中洗涤2次，并在38.5℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养27h。选择具有膨胀积云的COC用于随后的体外受精。

1.5.2 体外受精前的精子处理

取约100μL解冻精液，用5mL精子BO培养基稀释，25℃、1 200r/min离心5min。丢弃上清液并将精子颗粒重新悬浮在同一介质中。重复此步骤3次以去除所有精浆。将所得精子沉淀重悬在BO培养基中，并在含有50μg/mL肝素的BO培养基中按1:1稀释。精子在38.5℃、CO2浓度为5%的培养箱中培养1～2h，直到用于体外受精。

1.5.3 体外受精

体外成熟27h后，将卵母细胞转移到100μL BO培养基（石蜡油下）中，将获能的精子悬浮液加入液滴中，使精子终浓度达到5×106个活细胞/mL。置于38.5℃、CO2浓度为5%的培养箱中24h进行体外受精。

1.5.4 体外胚胎培养

受精后24h，清洗假定的受精卵以分离黏附的精子细胞。将假定的受精卵置于CO2培养箱中，在38.5℃、CO2浓度为5%的环境中，在胚胎发育培养基（含10%胎牛血清和3mg/mL牛血清白蛋白的mCR2aa培养基）中培养9d。

1.5.5 体外胚胎发育评价

授精后，每48h向一半培养基补充新鲜培养基。在倒置相差显微镜下对胚胎进行形态学评估。受精后48h测定卵裂率，胚胎培养第9天测定胚泡率。

1.6 统计学分析

所有数据均以“平均±标准差”表示。使用SPSS22.0进行统计分析。试验组每组6个重复，采用方差分析(ANOVA)和T检验定位差异，比较了精液质量和运动参数、质膜完整性和顶体完整性、受精率。P〈0.05时为显著差异。

2 结果与分析

2.1 不同冷冻程序对萨能奶山羊精液解冻后精子活力的影响

由表2可见，解冻后，使用冷冻程序C组的精子运动性能相关参数显著高于其他组（P〈0.05）。在多个质量参数中，使用冷冻程序B组和D组之间无显著差异（P＞0.05），但它们的TM、VSL、LIN参数明显高于A组和E组（P〈0.05）。

表2 不同冷冻程序对萨能奶山羊精液解冻后精子活力的影响

2.2 不同冷冻程序对萨能奶山羊精液解冻后精子质膜功能的影响

由表3可见，解冻后，使用冷冻程序C组的顶体完整性和质膜完整性明显高于其他组（P〈0.05）。使用冷冻程序B组和D组之间无显著差异（P＞0.05），且与A组和E组无显著差异（P＞0.05）。

表3 不同冷冻程序对萨能奶山羊精液解冻后精子质膜功能的影响

2.3 不同冷冻程序对萨能奶山羊卵母细胞体外受精和胚胎发育的影响

由表4可见，体外受精48h后测定的卵裂率，冷冻程序C组显著高于其他4组（P〈0.05）。在胚胎培养第9天测量的囊胚率，冷冻程序C组也显著高于其他4组（P〈0.05）。

表4 不同冷冻程序对萨能奶山羊卵母细胞体外受精和胚胎发育的影响

3 讨论

在精子冷冻过程中，存在冰晶损伤、敏感温度变化、稀释液渗透压变化、稀释液成分变化和离心处理等诸多问题。目前，在萨能奶山羊细管冻精研究上，程序化冷冻曲线的筛选处于空白阶段。降温速度过慢，精子因不能耐受物理温度而死亡；降温速度过快，精子的代谢活动增强，但存活的时间缩短[10]。因此，冷冻程序的筛选对于精液的冷冻保存非常重要。

本研究首次在萨能奶山羊全自动细管冻精上使用不同冷冻程序，阐明了在精液冷冻保存过程中最佳程序冷冻曲线对提高萨能奶山羊精液质量的重要性。从试验结果来看，利用冷冻程序C组可以显著提高精子活力和质膜功能的完整性。精子活力与生殖效率密切相关，精子解冻后的运动能力是冷冻保存和人工受精的重要预测指标之一。本研究结果表明，在-10～-140℃降温速率达到40℃min时精子解冻后的运动性能显著提高。降温速度是影响液态保存精液精子活力的主要因素，降温速度过快会降低精子活力，但是过慢甚至不降温，精子活力也会随保存时间的延长而衰减。在尽可能减少对精子影响的前提下尽量缩短降温过程是精液保存中的理想做法[11]。精子的质膜和顶体的完整性能够直接影响精子的受精能力。

本研究结果表明，当使用冷冻程序C组时，解冻后精子的质膜和顶体完整性得到显著改善。同样，对戴瑞羊的研究也证实，最适的降温速率可以改善精子质膜功能[12]。体外受精试验可以直观地反映精子的受精能力，卵裂和囊胚阶段是胚胎发育的重要时期。通过比较在-10～-140℃危险温区内设置的5个不同降温速率，可以看出冷冻程序C组的降温速率不会对精子受精能力产生负面影响，相反可提高精子活力和精子形态，显著提高精子受精率。在本研究中发现在萨能奶山羊细管冻精过程中，精液在冷冻过程中有效避开形成冰晶的危险区域极其重要[13]，不当的冷冻保存程序可能造成引发精子在母畜生殖道内运动受损和生存率差等后果[14]。通过电脑编辑冷冻程序，控制冷冻温度变化，进而为研究冷冻温度变化曲线和精子活力变化提供参考。在制备萨能奶山羊细管冻精时，在-10～-140℃温区，降温速率应控制在40℃/min，从程序仪将细管冻精取出后直接投入液氮，这样精子就可以处于超低温状态下，抑制了精子的代谢活动，使其能量消耗停止，这样精液可以长期保存。

4 结论

综上所述，在萨能奶山羊全自动细管冻精制作上，程序化冷冻曲线使用起始温度5℃；5～-10℃，降温时间150s（降温速率6℃/min）；-10～-140℃，降温时间195s（降温速率40℃/min）冷冻精液效果更好，可有效保证精子活力和质膜功能，提高解冻后精液质量。