响应面法优化糯玉米淀粉酶解工艺制备抗消化淀粉

孙琳琳 ，李克文 ，孙桂莲 ， 龚魁杰 ，， 刘开昌 ，

（1. 山东省农业科学院作物研究所，山东 济南 250100；2. 保龄宝生物股份有限公司，山东 禹城 251200）

糯玉米，也称蜡质玉米，在我国广泛种植[1]。糯玉米中淀粉含量为65%～75%，糯玉米淀粉基本上是由支链淀粉组成[2]，与普通玉米淀粉相比，易糊化、膨胀力高、黏滞性大和透明度高，经常在酿酒、制药、食品添加剂及饲料等方面有很好的应用[3-5]。糯玉米淀粉经改性后，其开发利用前景更为广泛。

根据淀粉消化特点将淀粉分为快速消化淀粉、慢消化淀粉和抗性淀粉[6]。快速消化淀粉是指在小肠内被迅速消化吸收的淀粉；慢消化淀粉指小肠内被完全消化吸收，但吸收速度较慢的淀粉[7]；抗性淀粉指不能被小肠的淀粉酶消化吸收的淀粉[8]，其主要在大肠中发酵，产生短链脂肪酸，RS3 是膳食中抗性淀粉的重要成分[9-10]。抗性淀粉和慢消化淀粉均具备营养与功能的双特性，对糖尿病和肥胖症等慢性疾病有一定的预防和控制作用[11-13]。

采用酶法制备慢消化淀粉和抗性淀粉，无化学残留、安全，符合食品发展的趋势。糯玉米淀粉高度分支，用于制备慢消化淀粉和抗性淀粉具有比普通玉米淀粉更高的制备效率。淀粉酶是一种脱支酶，对α-1,6- 糖苷键水解具有很强的专一性[14]。试验采用单因素试验考查不同因素对SDS 和RS 含量的影响，通过响应面试验进一步优化制备工艺，为异淀粉酶对糯玉米淀粉SDS 和RS 的制备提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糯玉米淀粉，市售；猪胰α - 淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶，Sigma 公司提供；醋酸钠、DNS、无水乙醇等，均为分析纯试剂。

KjeitecTM 8400 型凯式定氮仪，丹麦FOSS 公司产品；GL124-1SCN 型分析天平，德国赛多利斯有限公司产品；PKDD-5 型大容量离心机，湖南平科仪器有限公司产品；GZX-9240MBE 型电热鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；UV-2600型紫外- 可见分光光度计，日本岛津公司产品；FE28-bio pH 计，瑞士梅特勒- 托利多有限公司产品；JYL-Y92 型粉碎机，山东九阳电器有限公司产品；DK-98-ⅡA 型数显电子恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 体外消化性测定方法

参考文献[15-16]中的方法稍作修改，称取1 g 淀粉样品（干基），将其溶于0.1 mol/L 的醋酸钠缓冲液（pH 值5.2） 20 mL 中，在漩涡混匀器上剧烈混匀，加7 粒玻璃珠振荡水浴5 min，加入5 mL 混酶液（猪胰α - 淀粉酶活性为290 U/mL，淀粉葡萄糖苷酶15 U/mL）。将此混合溶液在37 ℃下以转速180 r/min振荡水浴。在20，120 min 时取样0.5 mL，加入20 mL的无水乙醇离心管中灭酶，以转速4 000 r/min 离心10 min。采用DNS 法测定葡萄糖含量。

20 min 测定获得葡萄糖含量为快速消化淀粉（RDS），20～120 min 测定获得葡萄糖含量为慢消化淀粉（SDS），120 min 时仍未消化的淀粉为抗性淀粉（RS）。

1.2.2 糯玉米淀粉酶解工艺

参考文献[17-18]方法稍作修改，取适量糯玉米淀粉配制成20%淀粉乳，微波使淀粉完全糊化，然后冷却至酶解温度，添加适量异淀粉酶在最适pH 值5.8 条件下酶解脱支处理一定时间，酶解结束后，马上将溶液加热到100 ℃保持15 min 灭酶。之后用冰浴迅速冷却至室温，调节pH 值至中性，离心取上清，最后在4 ℃条件下冷藏老化一定时间，然后置于鼓风干燥箱中45 ℃下烘干，粉碎，测定SDS+RS的含量。

1.2.3 单因素试验设计

以酶解时间（15，30，60，90，120 min）、酶添加量 （1，3，5，7，9 U/g）、酶解温度 （40，45，50，55，60 ℃）、老化时间 （12，24，48，72，96 h） 为影响因素，分别考查各因素对SDS+RS 含量的影响。

1.2.4 响应面优化试验设计

运用Design Expert 8.0.6.1 软件，采用响应曲面法，以SDS+RS 含量为指标对酶解条件进行优化，根据试验数据进行回归拟合建立回归模型。

因素与水平设计见表1。

表1 因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶解时间对SDS+RS 含量的影响

酶解时间对SDS+RS 含量的影响见图1。

图1 酶解时间对SDS+RS 含量的影响

由图1 可看出，随着酶解时间的增加，SDS+RS含量呈现先上升后降低的趋势，在酶解时间为60 min时，SDS+RS 含量达到最高为29.373%±0.141%。酶解时间在15～60 min 时，SDS+RS 含量增加较快，酶解时间超过60 min 时，SDS+RS 含量呈现缓慢下降的趋势，可能是由于随着酶解时间的延长，异淀粉酶会把糯玉米淀粉分解为小分子糖类，使直链淀粉含量下降，不利于老化，使得SDS+RS 含量下降。因此，酶解时间选择60 min 为最佳。

2.1.2 酶添加量对SDS+RS 含量的影响

酶添加量对SDS+RS 含量的影响见图2。

图2 酶添加量对SDS+RS 含量的影响

由图2 可看出，随着酶添加量的增加，SDS+RS含量呈现先上升后下降的趋势，酶添加量由1 U/g 增加到3 U/g，SDS+RS 含量急速上升为27.267%±0.316%，而随着酶量的继续增加，SDS+RS 含量却出现了下降趋势，这可能是过多的异淀粉酶进一步酶解直链淀粉为麦芽糖和麦芽二糖[19]，过短直链淀粉对SDS+RS 的形成重组有消极影响。因此酶添加量选择3 U/g 为最佳。

2.1.3 酶解温度对SDS+RS 含量的影响

酶解温度对SDS+RS 含量的影响见图3。

图3 酶解温度对SDS+RS 含量的影响

由图3 可看出，糯玉米SDS+RS 制备过程中SDS+RS 含量随酶解温度的增加呈先上升后下降的趋势，酶解温度为50 ℃时，SDS+RS 含量最高为28.330%±0.353%。这可能是与异淀粉酶活性受温度影响有关，温度太高会抑制异淀粉酶活性[20]。因此，酶解温度选择50 ℃为最佳。

2.1.4 老化时间对SDS+RS 含量的影响

老化时间对SDS+RS 含量的影响见图4。

图4 老化时间对SDS+RS 含量的影响

由图4 可看出，SDS+RS 含量的变化随着老化时间的延长呈现先上升后下降的趋势，老化时间48～96 h下降趋势较为平缓，由27.267%±0.316%下降到26.175%±0.200%，因此老化时间选择24 h 为最佳。

2.2 响应面试验酶解工艺优化

2.2.1 模型建立与分析

为确定糯玉米淀粉酶解的最优工艺条件，在单因素试验基础上，以SDS+RS 含量为响应值进行响应面回归分析。

Box-behnken 设计方案及试验结果见表2。

表2 Box-behnken 设计方案及试验结果

利用Design Expert 软件，通过表2 中试验数据进行多元回归拟合，得到回归模型为：

回归模型方差分析见表3。

表3 回归模型方差分析

对SDS+RS 方差分析结果表明，所建立的二次回归模型是极显著的（p＜0.01），失拟项差异不显著，p=0.146 2＞0.05，说明试验的二次多项式回归无失拟性因素存在，回归模型与试验值结果拟合较好，具有代表性。回归方程中一次项A、B 表现极为显著，一次项C 表现为显著，而二次项BD 表现为显著，二次项CD、A2、B2、C2、D2表现为极显著，说明这些因素对响应值的影响较大，且各因素之间非简单的线性关系。同时，回归方程的复相关系数R2=0.968 9 和R2Adj=0.937 9，说明可以利用该回归方程对酶解工艺进行分析和预测。根据回归模型方程中各因素回归系数绝对值大小，可知各因素影响SDS+RS 含量的顺序为酶添加量（B） ＞酶解时间（A） ＞老化时间（C） ＞ 酶解温度 （D）。

2.2.2 响应面分析及优化

各因素交互作用对SDS+RS 含量影响的响应曲面图见图5。

图5 各因素交互作用对SDS+RS 含量影响的响应曲面图

根据回归方程，作出响应面，考查拟合响应曲面的形状，分析4 个因素对SDS+RS 含量的影响。通过Design Expert 软件分析，得出糯玉米淀粉酶解最佳工艺条件为酶解时间48.88 min，酶添加量2.69 U/g，老化时间23.78 h，酶解温度49.62 ℃，此时SDS+RS含量预测值为34.200 6%。考虑到实际操作情况，将条件修正为酶解时间49 min，酶添加量2.7 U/g，老化时间23.8 h，酶解温度49 ℃，在此条件下做验证试验，得到SDS+RS 含量为34.103%，与模型预测值较为接近。采用响应面法优化得到的酶解工艺条件比较可靠，具有一定的实用价值。

3 结论

通过研究酶解时间、酶添加量、老化时间、酶解温度对糯玉米淀粉酶解提高SDS 和RS 含量的影响，采用异淀粉酶对糯玉米淀粉进行酶解，通过单因素试验和响应面法对酶解糯玉米淀粉工艺进行优化。最佳工艺条件为酶解时间49 min，酶添加量2.7 U/g，老化时间23.8 h，酶解温度49 ℃，在此优化条件下酶解糯玉米淀粉得到SDS+RS 含量为34.103%。在后续研究中可对酶解液进行纯化以提高SDS 和RS含量。