云南广南天然蒜头果可培养内生及根际真菌多样性分析

雷小铃 潘 悦 张丽丽 王 明 陆成军 李进宝 毛 平 王 娟

（1. 西南林业大学地理与生态旅游学院，云南 昆明 650233；2. 西南林业大学绿色发展研究院，云南 昆明 650233；3. 西南林业大学林学院，云南 昆明 650233；4. 广南县林业与草原局，云南 广南 653300）

蒜头果（Malania oleifera）属铁青树科蒜头果属，是我国特有单种属古老植物，国家Ⅱ级珍稀濒危保护树种，云南省极小种群重点拯救保护对象[1]。蒜头果种仁油中富含神经酸，对提高脑神经的活跃程度，防止脑神经衰老有重要作用[2]，同时，蒜头果种子中的油脂成分也是合成麝香酮的理想原料[3]。此外，蒜头果也是石漠化治理的优良树种[4]，因此，该树种具有重要的经济和生态价值。近年来，在云南省蒜头果原产地不断扩大规模进行人工种植，然而，其培育周期长，幼苗成活率和造林保存率较低[5]，相关研究表明[6]蒜头果幼苗第3年造林保存率仅为24.6%。如何提高蒜头果的种植存活率，缩短其生长周期，增强植株抗性，是蒜头果产业发展迫切需要解决的问题。

植物的内生、根际真菌不仅与其营养摄取、生长发育及存活率紧密相关，也对植物免疫系统调节起着重要作用。内生真菌能增强植物对磷、钾、铁等营养元素的吸收[7-8]，产生生长调节剂，增强植株的水分利用率和光合效率，促进植物种子萌发、根系生长及生物量的增加[9-10]，同时，对多种病虫害具有抑制效果[11-12]。根际有益真菌具有分解有机质为植物提供养分的功能，同时可抑制病原菌，对土壤质地和结构的形成、土壤肥力的提高等具有重要作用[13]。

内生真菌的种类和多样性受多种因素的共同影响，包括宿主植物的种类、生长环境、生长年限、气候条件（海拔、温度、湿度）等[12]。王毅等[14]研究了广南县裸露石灰岩山地和石灰岩林地中蒜头果不同器官的内生真菌多样性，结果表明石灰岩林地蒜头果根、叶的内生真菌多样性较裸露石灰岩山地丰富，然而，与蒜头果营养摄取和生长发育密切相关的根际真菌以及海拔对蒜头果内生、根际真菌的影响还鲜有报道。因此，本研究根据广南县天然蒜头果的区域分布特点，选取并采集2个不同海拔石灰岩林地以及1个裸露石灰岩山地的健康蒜头果植株及根际土壤进行内生、根际真菌的分离、纯化及种类鉴定，系统分析内生真菌不同器官及根际真菌的多样性，揭示高海拔与低海拔石灰岩山地蒜头果以及相同海拔条件下石灰岩林地和裸露石灰岩山地的蒜头果内生、根际真菌多样性，为丰富蒜头果微生物资源库，探讨生境对其真菌多样性的影响，挖掘蒜头果真菌资源的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年4月在文山州广南县天然蒜头果集中分布区选取3块样地，包括石灰岩林地和裸露石灰岩山地（地理信息见表1），蒜头果树龄约为40年（胸径：（11.9 ± 2.9）cm，树高：（7.4 ±2.8）m，每块样地根据实际面积按照五点取样法选取5株正常生长且无病害症状的蒜头果植株，共计15株，取其根、茎、叶和根际土，用无菌自封袋密封编号后置于车载冰箱，带回实验室进行内生及根际土壤真菌的分离、鉴定。

表 1 广南县蒜头果采样点地理信息Table 1 Geographic information of M. oleifera sampling points in Guangnan County

1.2 真菌的分离与培养

蒜头果根、茎、叶用自来水冲洗干净后进行超声震荡，然后将根、茎、叶用75%乙醇浸泡3 min，再分别用0.5%的次氯酸钠溶液处理8、5 min和3 min，无菌水冲洗3遍后，通过漂洗液涂布法检测表面消毒的效果[15]。将处理好的植物材料在超净工作台上自然风干，剪成约0.5 cm × 0.5 cm的小块，每皿5片接种于含链霉素（50 mg/μL）和 氨 苄 青 霉 素（50 mg/μL） 的PDA培 养 基 上（200克马铃薯，20克葡糖糖，10克琼脂粉和1 000 mL蒸馏水），每样品重复6皿，各30个组织块，即每样地每个部位（根、茎、叶）各取150个组织块进行分离。

根际土样品去除残根、碎石等杂物后经孔径2 mm的筛网混匀过筛，按水土比9∶1的比例混合，加入适量玻璃珠，在150 r/min 转速下震荡30 min后静置10 min。通过梯度稀释法的预实验结果[16]，最终选取10-3、10-4为最佳稀释倍数，吸取100 μmol/L土壤悬浮上清液均匀涂布于PDA培养基，每稀释倍数重复3次。

将上述培养皿在25℃恒温箱中培养3～4 d。挑取菌落边缘菌丝进行分离纯化，并接种于PDA斜面于4℃下低温保藏。

1.3 真菌的鉴定

将真菌菌株接种在PDA培养基黑暗培养7～10 d，根据菌落形态初步确定菌株种类。参照尿素提取法进行DNA提取[17]。选用引物ITS1F和ITS4对真菌ITS1-5.8S-ITS2基因片段进行PCR扩增[18-19]。经电泳检测扩增结果后将PCR产物送昆明硕擎生物科技有限公司测序。获得的序列经CExpress软件双向拼接后与GenBank上的已知序列进行比对。选取参考序列与代表菌株的结果序列经ClustalX18.1对齐后，在MEGA6.0手动校对，并通过邻接法（Neighbor joining，NJ）构建系统发育树。

1.4 分析方法

真菌的分离频率（SF）是衡量蒜头果中某种（或某属）真菌的优势度[15]，即分离频率（%）= 分离到某种（某属）真菌的菌株数/分离到的菌株总数。其中SF ≥ 10%为优势种（属），SF ≥ 1%为常见种（属），SF ＜ 1%的为稀有种（属）[20]。

式中：Pi=Ni/N，Ni为第i个种（属）数的个体数；N为所有种（属）数的个体数；S为种（属）数。

相似性系数（SC）：SC = 2j/(a+b)，描述2个样本间真菌物种组成的相似程度。其中，j为2个样本共同的真菌种（属）数，a和b分别为不同样本内的真菌种（属）数。

2 结果与分析

2.1 蒜头果内生、根际土壤真菌种类组成

3个样地共分离获得真菌276株，其中，内生真菌218株，根际土壤真菌58株，经ITS序列鉴定，分属3门8纲35个属（图1）。其中优势菌属为木霉属（Trichoderma），间座壳属（Diaporthe）和镰孢属（Fusarium），分离频率分别为24.28%、13.04%和10.15%，常见属为拟茎点霉属（Phomopsis）、叶点霉属（Phyllosticta）、青霉属（Penicillium）、蓝状菌属（Talaromyces）、新壳梭孢属（Neofusicoccum）、黑孢霉属（Nigrospora）、链格孢属（Alternaria）、炭皮菌 属（Biscogniauxia）、炭 疽 菌 属（Colletotrichum）、葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）、炭角菌属（Xylaria）、裂褶菌属（Schizophyllum）、耙菌属（Irpex）以及附毛菌属（Trichaptum），余下18个属为稀有属（表2）。

2.2 不同器官蒜头果内生、根际真菌的群落组成

从蒜头果不同器官内生及根际真菌中分离出共有菌属8个，分别为木霉属、间座壳属、镰孢属、拟茎点霉属、炭皮菌属、炭疽菌属、新壳梭孢属和青霉属，表明蒜头果内生与根际真菌的群落组成存在一定联系。同时，不同器官内生及根际真菌种类和数量间存在明显差异。其中，茎部分离到的内生真菌数量及种类最多，为93株，分属23个属；其次是叶部分离到74株23个属，根部最少，仅分离到51株20个属，而根际土壤中分离出真菌58株20个属，其中特有属1种，为球座菌属（Guignardia）（图2）。

图 2 蒜头果内生、根际真菌属级水平的菌群组成Fig. 2 Community composition of endophytic and rhizosphere fungi at genus level in M. oleifera

表 2 蒜头果内生、根际真菌分离频率Table 2 Isolation frequency of endophytic and rhizosphere fungi in M. oleifera

图 1 基于ITS序列构建的蒜头果内生、根际土壤真菌代表菌株系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree of representative strains of endophytic and rhizosphere soil fungi in M. oleifera based on ITS sequences

续表 2

2.3 不同器官蒜头果内生、根际真菌的多样性分析

由表3可知，蒜头果不同器官及根际土的真菌多样性差异显著。其中茎部的内生真菌多样性、均匀度及丰富度指数为2.973、0.935和5.879，高于其他部位，根际真菌的优势度指数最高，为0.116。相似性系数表明，根部内生菌与根际真菌相似性系数最高，为0.654，与叶部内生菌相似度最低（SC = 0.5）（表4）。

表 3 蒜头果不同器官内生真菌及根际土壤真菌多样性指数Table 3 Diversity index of endophytic fungi from different organ and rhizosphere soil fungi in M. oleifera

表 4 蒜头果不同器官内生真菌及根际土壤真菌相似性系数Table 4 Similarity coefficients of endophytic fungi from different issues and rhizosphere soil fungi in M. oleifera

2.4 不同生境蒜头果内生、根际土壤真菌的群落组成

2.4.1 相同同海拔下的群落组成

在相同海拔下，裸露石灰岩山地（DY）分离到蒜头果内生、根际真菌112株，分属30个属，而石灰岩林地（DB）分离到99株，包括24个菌属，其中木霉属和间座壳属为2个样地共有的优势菌属，且石灰岩林地中分离到的属在裸露石灰岩山地中均有出现（图3），表明二者的菌群结构具有一定的相似性。相较石灰岩林地，裸露石灰岩山地还分离出6个特有属，分别为木腐菌属，拟多隔孢属，白腐菌属， 伞状霉属，小贝氏孢属和光柱担菌属，由此表明同海拔下，裸露石灰岩山地（DY）的蒜头果内生、根际真菌种类和数量较石灰岩林地（DB）丰富。

图 3 相同海拔下裸露石灰岩山地和石灰岩林地蒜头果内生、根际真菌的群落组成Fig. 3 Community composition of endophytic and rhizosphere fungi of M. oleifera in bare limestone mountains and limestone woodlands at the same altitude

2.4.2 不同海拔下的群落组成

通过广南县天然蒜头果资源调查，该植株主要 分 布在 海 拔1 200～1 500 m的区域[21]，因 此，本研究将董堡乡八角山样地（海拔1 175 m）设定为低海拔石灰岩林地，而南坪镇庄科村样地（海拔1 435 m）设定为高海拔石灰岩林地。低海拔石灰岩林地（DB）中分离到蒜头果内生、根际真菌99株，分属24个属；高海拔石灰岩林地（NZ）分离到65株，19个属。2个样地共有属为12种，与此同时，均分离到一些特有菌属，其中低海拔石灰岩林地分离到12个特有属，分别为：金色毛壳菌属，曲霉属，蓝状菌属，炭团菌属，可可毛色二孢属，炭层菌属，葡萄座腔菌属，新拟盘多毛孢属，裂褶菌属，附毛菌属，耙菌属和盘菌属；高海拔石灰岩林地分离到7个特有属，分别为：木霉菌属，小脆柄菇属，Dactylonectria，黄癣菌属，无柄盘菌属，球座菌属和伞状霉属。由此表明，2个样地的菌群结构差异较大，低海拔石灰岩林地（DB）的蒜头果内生、根际真菌种类和数量较高海拔林地（NZ）丰富（图4）。

图 4 不同海拔下石灰岩林地蒜头果内生、根际真菌的群落组成Fig. 4 Community composition of endophytic and rhizosphere fungi of M. oleifera in limestone woodland at different altitudes

2.5 不同生境下蒜头果内生、根际真菌多样性分析

通过比较不同生境下蒜头果的内生、根际真菌多样性，结果表明，裸露石灰岩山地（DY）的蒜头果内生、根际真菌多样性指数与丰富度指数分别为2.727和6.123，较2个石灰岩林地高，3个样地由高到低的顺序为裸露石灰岩山地DY ＞低海拔石灰岩林地DB ＞ 高海拔石灰岩林地（NZ）；而辛普森优势度指数和均匀度指数则相反（表5）。此外，不同样地间蒜头果内生、根际真菌的菌群相似性存在明显差异，其中裸露石灰岩山地（DY）和低海拔石灰岩林地（DB）的菌群相似性最高，为0.8，而低海拔石灰岩林地（DB）和高海拔石灰岩林地（NZ）的菌群相似性最低（SC = 0.433）（表6）。

表 5 蒜头果3个样地内生、根际真菌多样性Table 5 Diversity of endophytic and rhizosphere Fungi of M. oleifera in 3 plots

表 6 蒜头果3个样地内生、根际真菌的相似性系数Table 6 Similarity coefficients of endophytic and rhizosphere fungi of M. oleifera in 3 plots

3 结论与讨论

本研究从广南县天然蒜头果3个不同生境分离到内生、根际真菌276株，涉及4个门9个纲34个属，表明该地蒜头果内生、根际真菌数量和种类较为丰富。王毅等[14]从广南县蒜头果的根、树皮及叶组织中分离获得112株内生真菌，其中紫霉属（Purpureocillium）、酵母样菌属（Acaromyces）、木霉属为优势菌属。本研究中除分离获得大量木霉属菌株外，未分离到紫霉属和酵母样菌属真菌，这可能与采集年份、样地及树龄差异等因素有关[22-24]。本研究结果显示木霉属、间座壳属、拟茎点霉属、青霉属和镰孢属真菌在3个样地中分离频率较高。其中木霉属真菌普遍被认为能促进植物根系生长、种子萌发以及磷的吸收[7]，还能分泌多种有机酸并通过碳源的新陈代谢溶解矿物质，起到土壤修复的作用[25]。而且木霉和青霉是重要的生防菌，能抑制多种病害尤其是土传病害的侵染[26-27]，因此具有重要的研究开发价值。在研究中分离得到的座壳属、拟茎点霉属和镰孢属真菌中的大部分种类被认为是植物病原真菌[28-29]，但也有一些种类能产生次生代谢产物对病虫害起到控制作用，因此认为宿主植物与内生真菌间存在一种动态的平衡关系[30]。但不同的真菌种类在蒜头果中发挥怎样的生态学作用还有待进一步研究。

本研究中，蒜头果茎部分离到的内生真菌多样性和丰富度指数最高，王毅等虽然仅分离茎部树皮的内生真菌，但结果显示无论是石灰岩林地还是裸露石灰岩山地，蒜头果树皮分离的内生真菌多样性指数高于根和叶部，与本研究的结论相似。根际土与根部菌群组成相似度较高，原因可能是根际土与根在长期互作中根际真菌选择性地进入植物根部[31]。而叶与根的相似度较低，可能与2种器官中内生真菌的来源不同有关。与紫茎泽兰叶和根的内生真菌相似度研究结果一致，被认为与叶部的内生真菌可能源自于空气，而根部内生菌主要来源与土壤有关[32]，这可能也是蒜头果地上和地下器官中菌群组成差异较大的原因，但蒜头果地上和地下部器官中的真菌来源还有待进一步研究证实。

影响植物内生、根际真菌的环境因素较多，如温度、湿度、海拔、土壤、光照、大气组成和采样季节等[12]。本研究中，相同海拔条件下，裸露石灰岩山地（DY）与石灰岩林地（DB）的蒜头果内生、根际真菌群落结构具有一定的相似性，但生长于裸露石灰岩山地的蒜头果内生、根际真菌种类及数量均较石灰岩林地丰富，原因可能与二者的土壤性质有一定关系，研究表明，蒜头果喜含钙量较高的土质[6]，下步可结合蒜头果这一特性分析土壤含钙量与其内生、根际真菌群落结构的关系。王毅等研究表明，蒜头果石灰岩山地和裸露石灰岩林地中树皮的真菌多样性相似，而根和叶的多样性均为石灰岩林地高于裸露石灰岩山地[14]。与本研究结果有所不同，原因分析其一可能是采样地不一样，前者的采样点位于旧莫乡的安勒村（裸露石灰岩山地）和岩腊村（石灰岩林地），由于文中未提及海拔和树龄信息无法进一步开展比较分析；其二可能是内生真菌分离样本数量的差异。此外，项目组对人工种植蒜头果开展内生、根际真菌的研究中发现裸露石灰岩纯林的蒜头果内生、根际真菌群落组成较石灰岩纯林丰富。相同的石灰岩林地生境中，低海拔分布的蒜头果内生、根际真菌的种类及数量较高海拔丰富，且两者差异较大，原因可能是低海拔石灰岩林地温度适宜、植被丰富、土壤养分充足，由此导致植物内生、根际真菌的群落多样性更为丰富，这与Shen等对长白山苔原沿海拔梯度升高其内生真菌多样性逐渐递减的规律相符[33]。

蒜头果不同生境间内生、根际真菌多样性指数与丰富度指数由高到低分别为裸露石灰岩山地（DY）＞ 低海拔石灰岩林地（DB）＞ 高海拔石灰岩林地（NZ）；而辛普森优势度指数和均匀度指数则相反，由此表明，裸露石灰岩山地（DY）的蒜头果内生、根际真菌群落更为丰富，高海拔石灰岩林地（NZ）的单菌属优势突出，菌落结构较为单一，因而均匀度指数高。

目前通过菌落形态和ITS基因片段，仅能将大部分蒜头果内生、根际土壤真菌鉴定到属级水平，下一步将针对有益优势菌属，联合分子条形码技术和微观形态学特征确定菌株种类，并开展促生功能筛选研究，为蒜头果微生物资源利用奠定基础。