PD-1/ICOS信号转换受体通过增强CD19-CAR-T细胞增殖能力提高其对DLBCL的杀伤活性*

加尔宝·吐尔德 阿迪娜·贾库林 闻淑娟

(新疆医科大学附属肿瘤医院 1.淋巴瘤内科;2.乳腺放疗科，新疆 乌鲁木齐 830011)

弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)是一种高度侵袭性和异质性的肿瘤，是非霍奇金淋巴瘤最常见的形式[1-2]。随着新型靶向治疗的发展，大部分DLBCL患者可以治愈[3]。然而，仍有40%～50%的DLBCL患者表现为难治性或复发的特点，最终死于疾病进展[4-5]。因此，DLBCL的治疗还需要探寻更多的治疗手段。

靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)已被批准用于复发难治性弥漫大B细胞淋巴瘤[6]。然而，免疫抑制微环境的存在显著削弱了CAR-T细胞在临床应用中的疗效[7-8]。前期研究[9-10]发现，PD-L1在DLBCL中显著高表达, 是此类患者不良预后因素。阻断PD-1/PD-L1信号是一种有效的增强B细胞淋巴瘤免疫应答的手段[11]。此外，研究[12-13]显示，包含ICOS胞内结构域的CAR增强了CAR-T细胞的效应功能和体内持久性。

在本研究中，为了逆转PD-1/PD-L1信号对T细胞的抑制作用，同时基于ICOS胞内结构域可以增强T细胞的效应功能和体内持久性的特点，我们将PD-1受体的胞外结构域与ICOS受体的胞内信号域融合，并将这种嵌合受体共表达在CD19-CAR-T细胞中，来探索这种新型CAR-T细胞对DLBCL的抑制活性。

1 材料与方法

1.1 细胞系、主要试剂、实验动物及血液样本 弥漫大B细胞淋巴瘤细胞DB购自武汉普诺赛生物科技有限公司。细胞培养基为RPMI-1640+10%胎牛血清，细胞培养在37℃，5% CO2条件下。过表达luciferase的DB细胞由本实验室先前构建保存。Ficol试剂购自北京索莱宝生物科技有限公司；CD3/CD28磁珠购自美国Invitrogen公司；IL-2购自美国Peprotech公司；Polybrene购自美国sigma公司；CFSE试剂购自美国Invitrogen公司；LDH细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；荧光素酶底物购自上海翌圣生物科技有限公司；FITC标记的CD19蛋白购自北京Acro公司；PE标记的抗Myc抗体，PE标记的抗CD69抗体购自美国Biolegend公司；FITC标记的抗CD3抗体，PE标记的抗CD4抗体，APC标记的抗CD8抗体购自北京义翘神州有限公司；过表达CD19-CAR以及过表达PD-1/ICOS-CD19-CAR的慢病毒购自上海汉恒生物科技有限公司。15只5周龄大小的雌性NCG小鼠(体重在23 g左右)购自新疆医科大学，小鼠饲养SPF屏障环境中，所有动物实验都经过我院伦理委员会批准。志愿者招募自我院体检中心3例健康体检者，其中男2例，女1例，平均年龄45岁(年龄范围40～49岁)，平均BMI为37.6 kg/m2(BMI范围为35.5～38.2 kg/m2)，每位志愿者抽取20 mL的外周血，抽血程序经过我院伦理委员会批准，志愿者签署知情同意书。

1.2 慢病毒感染法构建bbz以及PD-1/ICOS-bbz 按照制造商的说明，使用Ficol试剂从外周血中分离外周血单核细胞，然后按3∶1的磁珠与细胞比例加入CD3/CD28磁珠，在室温孵育30 min，之后将磁珠细胞混合物放入专用磁力架中静置5 min，连同磁力架一起倾倒管中的液体，之后用完全培养基将试管中的磁珠细胞混合物按1×106/mL重悬，培养48 h后，按MOI值为10分别加入过表达CD19-CAR以及过表达PD-1/ICOS-CD19-CAR的慢病毒，并额外添加6 μg/mL的polybrene，在水平离心机中按800 g离心90 min，之后放入培养箱中静置培养。24 h后更换新鲜的完全培养基，并在感染72 h后使用流式检测CAR-T细胞的阳性率。

1.3 流式细胞术检测bbz以及PD-1/ICOS-bbz的阳性率 分别取3×105个未感染的T细胞(Mock)，bbz以及PD-1/ICOS-bbz，PBS清洗3次后使用100 μL PBS重悬，之后加入5 μL PE标记的抗Myc抗体以及FITC标记的CD19蛋白，4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式细胞仪进行检测，结果使用Flowjo V10进行处理。

1.4 流式细胞术检测长期共孵育后T细胞中CD69的表达情况 分别取2×106个bbz以及PD-1/ICOS-bbz，按照试剂盒的说明用CFSE染料进行标记，之后按照效靶比为2∶1与DB细胞共孵育，每隔7 d加入新鲜的DB细胞，共添加3次，在共孵育35 d后，取20 μL细胞悬液，PBS清洗3次后使用100 μL PBS重悬，之后加入5 μL PE标记的抗CD69抗体，4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式细胞仪进行检测，结果使用Flowjo V10进行处理。

1.5 流式细胞术检测长期共孵育后T细胞的增殖情况 按照1.4的共孵育方法，每隔7 d取50 μL细胞悬液，利用T细胞标记CFSE的特性，使用流式细胞仪对CFSE+的细胞进行计数，以此来统计T细胞的增殖情况。

1.6 LDH释放法检测bbz以及PD-1/ICOS-bbz对靶细胞的细胞毒性 按照1.4的共孵育方法，在共孵育结束后，取2×106个细胞混合物，按照3∶1的磁珠与细胞比例加入CD3/CD28磁珠，在室温孵育30 min，之后将磁珠细胞混合物放入专用磁力架中静置5 min，连同磁力架一起倾倒管中的液体，得到T细胞。再按照效靶比为2∶1与DB细胞共孵育24 h，期间不添加任何细胞因子，之后按照制造商的说明使用LDH细胞毒性检测试剂盒检测对靶细胞的细胞毒性。计算公式为：细胞毒性或死亡率(%)=(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度) / (细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100。

1.7 体内移植瘤模型检测PD-1/ICOS-bbz的体内抗肿瘤活性 取5×106个DB-luciferase细胞，重悬于200 μL PBS中，通过尾静脉回输至NCG小鼠体内，接种7 d后，所有小鼠均成功长出肿瘤，将15只小鼠分为3组(Mock组，bbz组及PD-1/ICOS-bbz组，每组5只小鼠)，通过尾静脉分别回输1×107个效应细胞，在接种肿瘤细胞后第14 d腹腔注射1 mg/kg的luciferase底物，并通过活体成像仪对体内的肿瘤细胞进行成像。之后密切监控小鼠的死亡情况。

1.8 流式细胞术检测小鼠外周血中T细胞的比例 通过眼眶采血取50 μL小鼠外周血，使用350 μL红细胞裂解液室温裂解3 min，之后加入1 mL PBS混匀，清洗3次后，加入FITC标记的抗CD3抗体，PE标记的抗CD4抗体，APC标记的抗CD8抗体，4℃避光孵育30 min，PBS清洗3次后，使用流式细胞仪进行检测，结果使用Flowjo V10进行处理。

2 结果

2.1 慢病毒感染法构建bbz以及PD-1/ICOS-bbz 流式细胞术检测bbz及PD-1/ICOS-bbz的阳性率，结果显示，bbz和PD-1/ICOS-bbz中CD19-CAR的阳性率分别为31.1%和36.3%(见图1A)，而只有PD-1/ICOS-bbz中表达PD-1/ICOS嵌合受体，阳性率为42.2%，见图1B。

图1 bbz和PD-1/ICOS-bbz的表征

2.2 长期共孵育后PD-1/ICOS-bbz的激活水平更高 在经过35 d的体外共孵育后，流式细胞术检测T细胞表面激活marker的表达情况，结果表明，PD-1/ICOS-bbz较bbz CD69的表达水平显著提高(P<0.001),见图2。

图2 长期共孵育后bbz和PD-1/ICOS-bbz的激活

2.3 长期共孵育后PD-1/ICOS-bbz的增殖能力和细胞毒性水平更高 细胞增殖结果显示，在长期共孵育过程中PD-1/ICOS-bbz较bbz增殖能力显著提高(P<0.01)(见图3A)。此外，共孵育结束后取T细胞与DB细胞共孵育，结果表明，PD-1/ICOS-bbz较bbz对靶细胞的细胞毒性更高(P<0.01),见图3B。

图3 bbz和PD-1/ICOS-bbz长期共孵育后的增殖和细胞毒性

2.4 PD-1/ICOS-bbz显著清除小鼠体内的淋巴瘤细胞 使用小鼠移植瘤模型评估PD-1/ICOS-bbz体内抗肿瘤活性，活体成像结果显示，在第14 d时PD-1/ICOS-bbz治疗组体内肿瘤被完全清除，而bbz组仍有存活部分肿瘤细胞(见图4A)。生存结果显示，bbz治疗组的小鼠在43 d时已全部死亡，而PD-1/ICOS-bbz治疗组的小鼠在70 d时仍全部存活(P<0.01),见图4B。

图4 bbz和PD-1/ICOS-bbz对DB细胞的体内抗肿瘤活性

2.5 PD-1/ICOS-bbz具有更强的体内增殖能力 流式结果显示，PD-1/ICOS-bbz治疗组中外周血CD3+T细胞的数目较bbz组显著增多(见图5A)，且PD-1/ICOS-bbz治疗组的T细胞具有更多的CD8+T细胞的比例，表明其肿瘤杀伤能力更强，见图5B。

图5 bbz和PD-1/ICOS-bbz在体内的增殖

3 讨论

CAR-T细胞被认为是一种有效的B细胞淋巴瘤的治疗手段[14]。然而，现存的CAR-T细胞对复发/难治性DLBCL患者的疗效有限，客观缓解率只能维持在60%左右[15-16]。为了进一步提高CAR-T细胞对DLBCL疗效，降低肿瘤微环境的影响，我们构建了共表达信号转换受体的增强型CAR-T细胞。结果表明，含有PD-1/ICOS信号转换受体的CD19-CAR-T细胞能够特异性清除表达CD19的DLBCL，有效延长小鼠的生存期。此外，与二代的CD19-CAR-T细胞相比，含有PD-1/ICOS信号转换受体的CD19-CAR-T细胞具有显著的增殖优势，这种特性使PD-1/ICOS-bbz具有更强的临床应用潜力，因为到目前为止，大部分报道的经CAR-T细胞治疗失败的DLBCL患者，其外周血CAR-T细胞扩增都令人失望[17]。既往研究[18]报道，长期慢性刺激CAR-T细胞可导致其衰竭。而在本研究中，体外结果显示，在经过长期刺激后，PD-1/ICOS-bbz较bbz仍具有更好的肿瘤杀伤活性。

通过回输CAR-T细胞可以在体内产生有效的抗肿瘤作用，然而大多数肿瘤会采取多种策略来实现免疫逃逸。这种逃逸策略大致可以分为两类，一种是防止T细胞识别的策略，如目标抗原和主要组织相容性复合体表达下调[19-20]；还有就是通过限制T细胞持久性和效应功能的策略，如抑制配体/受体(如CTLA-4、PD-1和LAG-3)的表达[21-22]。研究人员已经通过设计抑制配体阻断剂，证明可以增强抗肿瘤免疫反应[23]。但系统性施用这类药物往往会引起较为严重的不良反应[24]。本研究设计的PD-1/ICOS信号转换受体使得回输的CAR-T细胞在肿瘤局部解除PD-1/PD-L1的抑制作用，有效减小全身的副反应。

先前的研究表明，ICOS共刺激受体被证明可以增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤活性[25]。此外，基于ICOS作为共刺激信号的CAR受体增强了CD8+T细胞的细胞因子释放和体内持久性[26]。本研究设计的PD-1/ICOS信号转换受体将肿瘤微环境中的PD-1信号转换为ICOS信号，证明的确可以增强CAR-T细胞的增殖活性。

CAR-T细胞应用于临床治疗时应该平衡疗效和毒性。然而，由于缺乏良好的动物模型，限制了对PD-1/ICOS-bbz毒性的评价[27]。尽管如此，我们可以在后续的研究中为PD-1/ICOS-bbz额外设计一些安全开关，使其即使发生不良反应，也可以及时采取相应手段予以控制[28]。

4 结论

本研究证实了通过逆转肿瘤来源的抑制信号来增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性的可行性。嵌合受体(PD-1/ICOS)与肿瘤细胞上的PD-L1结合，并激活ICOS受体相关的下游信号级联，增强CAR-T细胞的增殖能力及体内的抗肿瘤活性。该研究为DLBCL的治疗提供了一种潜在的方案，有望在不远的未来进行临床研究进一步探索其治疗效果。