破壁灵芝孢子粉破壁率的测定

高志城，周敏，张任广，苏水娇，宁礼信，黎子林

广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心），广东省化学测量与应急检测技术重点实验室，广东省原位电离质谱分析工程技术研究中心（广州 510070）

破壁灵芝孢子粉是开发较多的灵芝产品之一。研究表明，显微镜下破壁孢子粉与未破壁孢子粉的形态明显不同，同时经过破壁处理后，灵芝孢子中的还原性糖和多肽等化学成分更容易被提取出来，破壁孢子粉的醇提取液也比未破壁孢子粉具有更强的体外抗肿瘤活性[1-3]。因此，破壁率也常被认为是衡量灵芝破壁孢子粉质量的重要指标之一[4-6]。灵芝孢子粉破壁率的检测方法可分为血球计数法[7-8]、水装片结合显微技术法[9]、悬浮法结合物理技术[10-11]、化学指纹法[12]等。在“保健食品原料目录 破壁灵芝孢子粉 破壁灵芝孢子粉原料技术要求/理化指标 1 破壁率的测定”的基础上，改善相关试验条件，进行对比试验，建立一个适用于破壁灵芝孢子粉破壁率的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

蔗糖（分析纯，阿拉丁工业公司）；聚山梨酯-80（分析纯，广州化学试剂厂）。

1.1.2 主要仪器与设备

Olympus生物显微镜（CX23LEDRFS1C，奥林巴斯工业有限公司）；血球计数板（25个中格×16个小格，上海市求精生化试剂仪器有限公司）；超声波振荡器（AS3120型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；电热鼓风干燥箱（DHG-9140A，上海一恒科学仪器有限公司）；不锈钢药典筛6号；100 mL容量瓶。

1.2 样品制备

分别取同一批次有代表性灵芝孢子粉和破壁灵芝孢子粉的样品，各100 g，分别充分混匀，置于密闭的容器内。

1.3 样品前处理

取适量同一批次的灵芝孢子粉A和破壁灵芝孢子粉B，于烘箱60 ℃烘干5 h。

准确称取经烘干的孢子粉A1，A2和破壁灵芝孢子粉B1，B2，其中mA=0.100 0 g，mB=0.150 0 g。

对照组：分别称取5.0 g经过研磨后过0.150 mm（100目）筛的蔗糖粉末，分别与孢子粉A1、B1充分混合至色泽均一。用蒸馏水分别溶解上述样品，在样品溶液中加0.1 mL聚山梨酯-80，用蒸馏水定容到100 mL容量瓶中，并在室温超声振荡30 min，使孢子充分分散。

试验组：分别称取5.0 g经过3次重复研磨后过0.150 mm（100目）筛的蔗糖粉末，分别与孢子粉A2、B2充分混合至色泽均一。用蒸馏水分别溶解上述样品，在样品溶液中加0.1 mL聚山梨酯-80，用蒸馏水定容到100 mL容量瓶中，并在室温超声振荡60 min，使孢子充分分散。

1.4 测定

1.4.1 进样

将待测孢子悬液，用吸管吸取1滴置于盖玻片的边缘，使液体缓缓渗入，多余的液体用吸水纸吸取，进样完成后静置约30 s，将血球计数板置于400倍数的光学显微镜下进行观察计数。

1.4.2 灵芝孢子粉

置于显微镜下观察孢子呈卵圆形，顶端钝圆或截形，如图1所示。

图1 灵芝孢子粉显微形态（400倍）

1.4.3 破壁灵芝孢子粉

置于显微镜下观察，孢壁多破碎，可见多数黄褐色的大小不等的微粒、孢子破碎程度不同的壳段或孢子破碎后里面的黄色至黄褐色的内容物，如图2所示。

图2 破壁灵芝孢子粉显微形态（400倍）

1.4.4 观察计数

使用25个中格×16个小格的计数板，如图3所示，应计算出血球计数板4个角上与中央5个中格中含完整灵芝孢子的数目（即以80个小格为1个计数单位）[13-14]，每个样品有效观察计数不少于3次，计算它们的平均数n。

图3 血球计数板计数区域图

1.5 计算方法

使用25个中格×16个小格的计数板时，每克孢子粉中含完整灵芝孢子数按式（1）计算。

式中：N为每克孢子粉含完整的灵芝孢子数，个/g；n为80个小方格内含完整灵芝孢子的总数，个；V为孢子稀释液的体积，mL；m为样品的质量，g；400为血球计数板的计数室内共有400个小方格；10 000为血球计数板计数室的容积，为0.1 mm3，1 mL相当于10 000个血球计数板计数室的容积。

破壁率按式（2）计算。

式中：X为破壁灵芝孢子粉的破壁率，%；NB为每克破壁灵芝孢子粉中含完整的灵芝孢子数，个/g；NA为每克灵芝孢子粉中含完整的灵芝孢子数，个/g。

2 结果与分析

2.1 方法改变前结果

对样品A1、B1分别有效观察计数3次，计数结果见表1。灵芝孢子粉3次计数的平均值为99，相对标准偏差为10.25%；破壁灵芝孢子粉3次计数的平均值为3，相对标准偏差为21.65%；根据公式计算得出破壁率98%。

表1 方法改变前结果

2.2 方法改进后结果

对样品A2、B2分别有效观察计数3次，计数结果见表2。灵芝孢子粉3次计数的平均值为168，相对标准偏差为1.79%，破壁灵芝孢子粉3次计数的平均值为2，相对标准偏差为0.0%。根据公式计算得出破壁率99%。

表2 方法改进后结果

2.3 结果分析

试验结果表明，由于孢子悬液分布不均匀，样品A1、B1在原方法中与研磨后过0.150 mm（100目）筛的蔗糖粉末混匀后超声振荡30 min，破壁率为98%，每次计数的5个视野得到的数值不平均，3次计数的总数的相对标准偏差较大，而样品A2、B2在与经过3次研磨后过0.150 mm（100目）筛的蔗糖粉末混匀后超声振荡60 min，破壁率为99%，每次计数的5个视野得到的数值相对平均，3次计数的总数的相对标准偏差有明显降低，结果提高1%。

3 结论与讨论

3.1 讨论

为保证破壁率测试结果的准确性，因此对试验人员和试验用器具都有严格的要求。在实际检验过程中要注意几点：一是镜检计数室。因前一次清洗不到位，或者保存过程中存在污染，更或者因操作不当导致的计数室存在划痕，若不及时清洗或更换，则会对后期试验计数产生极大影响。所以，在每次使用血球计数板之前都需要认真镜检计数室，如若在镜检时发现计数室有污物，则需按要求清洗并吹干后进行试验[15]。二是摇匀后取液。在吸出孢子悬液进行计数之前，需轻轻振荡试管，使孢子分布均匀，防止聚集沉淀，从而提高计数的代表性和准确性。三是掌握计数原则，并采用“计上不计下，计左不计右”的计数原则[16]。四是通过延长超声振荡时间，重复多次研磨蔗糖粉末来解决孢子悬液分布不均匀的问题，提高试验的准确性。

3.2 结论

使用血球计数板的优点是试验成本不高、操作简单，适合于大批量、长期稳定的样品的分析，是生产企业和检验机构的不错的选择。但是由于孢子悬液分布不均匀的不确定性，也存在重复性差、准确度较低、测得的平行样的相对标准偏差大等缺点，试验通过延长超声振荡的时间，重复多次研磨蔗糖粉末，使孢子悬液分布更加均匀，明确计数原则减少计数误差，得到令人满意的试验结果。但尚有问题亟待解决：因为要将待测孢子悬液，用吸管吸取1滴置于盖玻片的边缘，使液体缓缓渗入，多余的液体用吸水纸吸取，在这个操作过程中容易造成气泡的产生，容易导致每次取样量不一致，导致结果存在误差。后续研究的重点就是解决因气泡产生造成的结果差异性的问题，简化分析程序，提高检测准确度，为实际检测工作提供有效参考和数据支持。