胡枝子叶斑病病原鉴定及其生物学性状

王 朵

（国家林业和草原局生物灾害防控中心，辽宁 沈阳 110034）

胡枝子Lespedeza bicolor是豆科Leguminosae胡枝子属Lespedeza直立多年生灌木，别名胡枝条、行军茶等[1]，广泛分布于黄河流域、江浙地带等[1-2]，在我国东北地区也有野生和种植。胡枝子根系发达且有分蘖，生长速度快，耐干旱贫瘠，具有改善生态环境的作用；胡枝子叶片数量多，富含蛋白质、微量元素等，可作为饲用植物使用[3]；胡枝子富含黄酮类化合物、萜类、生物碱等，具备很高的药用价值[4]。此外，胡枝子绿期长，花期晚，具有观赏价值，常在园林栽培[5]。胡枝子具有的多种潜在优势，使其越来越受到重视。

目前，胡枝子的研究以栽培技术、牧草饲料、医用价值等为主[3-5]，但对其病害的研究较少。笔者以辽宁铁岭地区胡枝子叶斑病为研究对象，明确其病原菌的种类，为胡枝子的病害识别和防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要供试材料

发病的胡枝子叶片采自辽宁铁岭。培养基有马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、燕麦培养基（OA）、麦芽浸汁培养基（MEA）和察氏培养基（Cza‐pek-Dox）。

1.2 病原菌的分离纯化与形态鉴定

采用植物组织分离法对病原菌进行分离与纯化[6]。分离出的菌株在27℃条件下恒温培养7 d，在菌落边缘挑取少许菌丝，待其产生分生孢子时，进行单孢分离纯化[7]，纯化后的菌株保存于20%灭菌甘油中，-20℃保存备用。将单孢纯化的菌株接种于PDA、OA和MEA培养基上，27℃分别培养7 d，观察菌落形态并拍照记录，用倒置荧光显微镜（ZEISS Axio Vert.A1）观察分生孢子形态，根据真菌鉴定手册[8]和相关资料进行形态鉴定[9]。将分离纯化的菌株编号为EL1。

1.3 分子生物学鉴定

采用CTAB法提取病原菌基因组DNA，用引物ITS1/ITS[10]、NL1/NL4[11]、T1/T2[12]、RPB2-xf/RPB2-xr[13]分别扩增菌株的ITS，核糖体大亚基（LSU），β微管蛋白（β-tubulin）和RNA聚合酶II（RPB2）的基因序列。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送往公司测序。从NCBI下载其他菌株的序列，用Sequence Matrix将菌株EL1的ITS、LSU、β-tublin和RPB2基因串联，Seaview4进行序列比对，用MEGA11构建联合基因系统发育树。

1.4 致病性测定

依据柯赫氏法则，将健康的1年生胡枝子叶片表面消毒后，接种直径5 mm的菌饼，菌丝面朝下，以无菌PDA培养基为对照，每次5片叶，重复3次。接种后将其放置于27℃恒温培养室培养7 d，相对湿度80%，每天观察发病情况，对出现发病症状的叶片，再次进行病原菌分离鉴定。

1.5 病原菌生物学特性研究

1.5.1 最适温度和pH值测定

将纯化后的菌株接种于PDA平板，27℃培养5 d后，在菌落边缘用打孔器制备直径5 mm的菌饼，将其转移至新的PDA平板，温度分别设5、10、15、20、25、27、30、35℃进行培养。

用1 mol·L-1的NaOH和HCl溶液将PDA培养基的pH值分别调至4、5、6、7、8、9后，分别在平板中央接种5 mm的菌饼，27℃培养7 d后，测定菌落直径。每种处理4次重复。

1.5.2 最佳碳源、氮源测定

以察氏培养基为基础培养基，以硝酸钾为氮源，选择16种碳源（棉籽糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、木糖、甘露糖、半乳糖、山梨醇、木糖醇、乳糖、甘油、阿拉伯糖），对照不添加任何碳源。

以蔗糖为碳源，选择23种氮源（牛肉粉、酵母粉、胰蛋白胨、硝酸钾、亚硝酸钠、硫酸铵、尿素、甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、半胱氨酸），对照不添加任何氮源。

两组处理培养温度均为27℃，培养时间7 d，每组处理重复4次。

1.5.3 菌丝致死温度测定

将直径5 mm的菌块放于含1 mL无菌水的离心管中，然后于40～50℃（温度梯度5℃）的恒温水浴锅中处理10 min。当离心管冷却后将菌块置于PDA平板，27℃恒温培养，每天观察记录并确定菌丝致死温度[13]。

2 结果与分析

2.1 分离菌株的形态

菌株EL1在PDA培养基上菌落背面橘黄色，边缘白色（图1A）；在OA培养基上，菌丝绒毛状，菌落灰白色（图1B）；在MEA培养基上，菌丝绒毛状（图1C），NaOH颜色反应为先绿色后棕色（图1D，E）。分生孢子椭圆形，无色透明，大小为（3.8～5.8）μm×（2.0～2.7）μm（图1F）。

图1 菌株EL1培养性状

2.2 分离菌株的致病性

田间采集的胡枝子叶片发病部位呈褐色，周围有黄色晕圈（图2A）；对照叶片未发病（图2B）；将分离菌株EL1的菌饼接种于胡枝子叶片，培养7 d后接种部位产生褐色病斑，病斑中心有白色菌丝（图2C）。将发病的叶片再次进行组织分离，分离到的菌株其培养性状与接种菌株一致，对照叶片未分离到致病菌株，表明分离到的菌株EL1为胡枝子叶斑病的病原菌。

图2 胡枝子叶片的发病症状

2.3 病原菌分子生物学鉴定

分离菌株EL1的ITS、LSU登录号分别为ON479323、ON495342；β-tubulin、RPB2基因登录号分别为ON530893、ON530892。Blast在线比对后，EL1与附球菌属Epicoccum真菌相似度达99%。菌株EL1与E.latusicollum聚为一支，节点自展支持率为99%（图3）。结合EL1的形态特征，将菌株EL1鉴定为E.latusicollum。

图3 基于ITS、LSU等基因的菌株EL1系统发育分析

2.4 病原菌的生物学特性

菌株EL1的生长温度范围5～35℃，最适生长温度为27℃。当温度为35℃时，菌丝未生长（图4A）。菌丝在pH值4～9范围内均可生长，最适pH值为6（图4B）。

图4 温度和pH值对菌株EL1生长的影响

该菌株在不同碳源的察式培养基上均可生长，以棉籽糖、葡萄糖和甘露糖为碳源时，菌丝生长速率快，菌丝致密；以阿拉伯糖为碳源时，菌丝生长速率最慢，菌丝稀疏（图5A）；菌株EL1在不同氮源的察式培养基上均可生长，以牛肉粉为氮源时，菌丝生长速率最快，但菌丝稀疏；以亚硝酸钠为氮源时，菌丝生长速率最慢，菌丝极为稀疏（图5B）。

图5 碳源和氮源对菌株EL1生长的影响

此外，菌株EL1经40～49℃水浴处理10 min，菌丝在PDA培养基上继续生长，但经50℃水浴处理10 min，菌丝不生长，表明该菌的菌丝致死温度为50℃，10 min。

3 讨论与结论

胡枝子叶片中酚类物质丰富，能显著减少病虫害的发生[14]，常见的病害是胡枝子锈病[15]。笔者发现胡枝子的一种病害，其叶片病部为褐色，有黄色晕圈，通过植物组织分离和形态鉴定，以及柯赫氏法则验证，确定分离到的菌株为胡枝子叶斑病的致病菌；基于形态学特征和多基因系统发育分析，确定分离菌株EL1为Epicoccum latusicollum，分类地位为子囊菌门Ascomycota亚隔孢壳科Didymellaceae附球菌属Epicoccum。

关于E.latusicollum的研究极少，局限于分类学的研究[16]。该菌主要分离于高粱Sorghum bicolor、野 山 茶Camellia pitardii、罗 汉 松Podocarpus macrophyllus等，被认为属于腐生菌或内生菌[16]；此外，该菌也可侵染胡颓子Elaeagnus pungens的叶片[17]、山药Dioscorea opposita茎蔓[18]和烟草Nicotiana tabacum的根与叶[19-20]。本试验对E.latusicol-lum生物学性状研究表明，该菌的最佳生长温度为27℃，最适pH值为6，最适碳源为棉籽糖，氮源为牛肉粉，菌丝致死温度为50℃、10 min。这为该病害的正确识别和防治提供一定的理论依据。