尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶的制备及体外评价

王 慧，邵 青，张 燕，杨苗苗，胡婕雯，龚阳泽

西安市精神卫生中心，西安 710061

尼古丁[1-3]又名烟碱，是脂溶性物质，很容易通过人体的皮肤、黏膜组织吸收，适用于透皮给药系统(transdermal delivery systems, TDS)。但其见光、遇热易分解易挥发等性质在一定程度制约了其外用制剂的开发与应用[4]。

二元醇脂质体[5]是在乙醇的的基础上加入无色黏稠的丙二醇，增加乙醇脂质体的稳定性，并改善乙醇易挥发及皮肤刺激性大的缺点。但二元醇脂质体为液态，经皮给药不方便。温敏凝胶[6]是受温度影响而发生相变化的智能凝胶，胶凝温度最接近人体皮肤温度(32 ℃)，能较好地黏附于皮肤表面，延长药物的作用时间。因此，本试验制备尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶，并对其进行体外释放评价，使药物更易透皮吸收。

1 仪器与材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪系统(日本岛津公司)；激光共聚焦显微镜(德国徕卡有限公司)；药物溶出仪(天津市精拓仪器科技有限公司)；高速离心机(湖南郝西仪器设备有限公司)；透皮扩散实验仪(上海罗中科技发展有限公司)。

1.2 试药

尼古丁(博腾药业有限公司，质量分数>96%)；卵磷脂(PC上海爱康精细化工有限公司，质量分数90%)；罗丹明B、泊洛沙姆407(P407)和泊洛沙姆188(P188)均购自西格玛奥德里奇有限公司；透析袋(截留相对分子质量为8 000～12 000，北京鹏成生物所分装)；甲醇(色谱纯，深圳立业实业有限公司)。

1.3 动物

昆明种小鼠(许可证号SCXK(甘)14-006，合格证：医动字第14-006号，兰州大学动物实验中心)。

2 方法

2.1 含量测定

2.1.1色谱条件 Kromasil C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：三乙胺-甲醇-0.02 mol·L-1醋酸铵(0.1∶30∶60)，过滤(0.45 μm微孔滤膜)、脱气；流速：1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃；检测波长为365 nm；进样量为10 μL。

2.1.2标准曲线及线性范围 精密称取一定量尼古丁对照品，加甲醇溶液并定容，得对照品溶液。精密量取该对照品溶液，用甲醇将其稀释成不同质量浓度的溶液(0.62、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00、20.00 μg·L-1)。按2.1.1项下色谱条件，进样分析，以峰面积(A)对质量浓度(C)进行回归，线性回归方程A=87 345C+35 671，r=0.999 8，表明尼古丁在20～0.62 μg·L-1内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.3精密度 精密量取尼古丁对照品溶液，用甲醇将其稀释成高、中、低(20、10、5 μg·L-1)的质量浓度的对照品溶液，测日内精密度(5次)；测日间精密度(连续3 d)。结果，日内及日间RSD分别为2.11%、2.08%，表明该方法精密度良好。

2.1.4回收率 在5 mL量瓶中放入空白二元醇脂质体，加入用乙醇稀释的0.62、5.00、20.00 μg·L-1尼古丁溶液，振荡，离心5 min，进样测定。计算样品溶液的平均回收率为(99.70%±3.12%)，RSD为0.91%，表明该方法回收率良好。

2.2 制备尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶

2.2.1制备尼古丁二元醇脂质体 以包封率、透皮量及稳定性为考察因素[7]，预实验结果显示，当乙醇∶丙二醇为5∶5时，包封率最高，稳定性最好，透皮量最大。精密称取处方量的尼古丁、磷脂PC和罗丹明B溶于4.5 mL上述醇溶液中(乙醇-丙二醇为1∶1)，将PBS(pH 6.5)5.5 mL 缓慢注入，整个过程在密闭恒温容器中以700 r·min-1的转速不断搅拌20 min，制备过程中保持体系在(30±1) ℃，室温冷却30 min，过滤，得二元醇脂质体[8]。

2.2.2二元醇脂质体形态的测定 将制得的尼古丁二元醇脂质体样品用共聚焦激光扫描电镜观察其形态[7]，显示尼古丁二元醇脂质体均呈类球形或球形的囊泡。结果见图1。

图1 尼古丁二元醇脂质体荧光素共聚焦激光扫描图

2.2.3尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶制备 冷溶法[9]制备温敏凝胶。西林瓶中放入处方量的P188、P407，加入蒸馏水2.0 mL，放置24 h，使凝胶完全润湿，得到无团块的空白凝胶。冰水浴中放入P188/P407空白凝胶西林瓶，边加热边搅拌，在搅拌中缓慢加入尼古丁二元醇脂质体3.0 mL，15 min后，制得P188/P407尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶。

2.3 胶凝温度的测定

搅拌子法[10]测胶凝温度。在塞西林瓶中放入磁搅拌子并加入适量尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶，水银球浸没在凝胶中，以500 r·min-1进行搅拌，缓慢升温，当搅拌子完全静止的温度为胶凝温度，连续测定3次。

2.4 尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶处方筛选

本实验选用最接近人体皮肤温度(32 ℃)为衡量凝胶的最重要指标。通过预实验发现，对胶凝温度影响较大的因素分别为药物量、P188及P407的配比。

2.4.1药物量对胶凝温度的影响 实验固定P188为凝胶量3.0%，P407为凝胶量30%，分别加入1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 的二元醇脂质体，研究药物量对胶凝温度的影响。结果见表1。

表1 不同含量药物对胶凝温度的影响

2.4.2P188对胶凝温度的影响 实验固定P407为凝胶质量分数的 30%，尼古丁二元醇3 mL，分别加入凝胶量2.6%、2.8%、3.0%、3.2%、3.4%的P188，制备温敏凝胶并测定胶凝温度。结果见表2。

表2 不同含量P188对胶凝温度的影响

2.4.3P407对胶凝温度的影响 实验固定P188为凝胶量的 3.0%，尼古丁二元醇3 mL，分别加入质量分数26%、28%、30%、32%、34%的P407，制备温敏凝胶并测定胶凝温度。结果见表3。

表3 不同含量P407对胶凝温度的影响

单因素结果显示，当P188及P407含量一定时，胶凝温度随着尼古丁二元醇脂质体量的增加而升高，当尼古丁二元醇为3 mL时，此时的温敏凝胶温度为(32±0.70) ℃。当P407及药物含量一定时，胶凝温度随着P188含量的升高而升高，当P188为3.0%时，此时的温敏凝胶温度为(32±0.50) ℃。当P188及药物含量一定时，胶凝温度随着P407含量的升高而逐渐降低，当P407质量分数为30%时，此时的温敏凝胶温度为(32±0.90) ℃。三者都最接近人体温度。

由表1至表3可见，温敏凝胶的最优处方为尼古丁二元醇脂质体 3 mL、含3.0% P188及30% P407。按最优处方制备尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶，并测定其胶凝温度(n=3)，结果平均凝胶温度为(32±0.30) ℃。

2.5 尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶体外释放评价

分别取含相同剂量尼古丁的体积分数为45%的乙醇溶液、二元醇脂质体及P188/P407二元醇脂质体温敏凝胶，放入透析袋中，扎紧袋口，固定于桨上[11]，体积分数为45%的乙醇溶液作为接收液，在温度为(32±1) ℃、转速为100 r·min-1的释放条件下，分别在规定的时间点(1、2、4、6、8、10、12、24 h)取1 mL接收液，及时补充同温度同体积的接收液，样品1 mL过滤，进样10 μL，根据标准曲线得规定时间点的累计释放百分比。结果见表4。

表4 尼古丁不同制剂体外累积释放百分比

结果表明 ，尼古丁不同制剂在24 h内的药物释放情况，尼古丁二元醇脂质体在前3 h内药物已经释放接近100%，可见透析袋对游离药物基本无阻碍作用。同样的释放条件下，尼古丁二元醇脂质体凝胶的药物释放比尼古丁二元醇脂质体有显著的延缓作用，这可能是二元醇脂质体温敏凝胶的药物一部分包裹在囊泡中，一部分分散于凝胶网络结构中，包裹于囊泡中的尼古丁先从囊泡中释放到凝胶中，再从凝胶中缓慢释放到介质中，减缓了药物的释放速度[12]，结果显示二元醇脂质体温敏凝胶有更好的缓释作用。

2.6 小鼠皮肤二元醇脂质体及其温敏凝胶分布

2.6.1给药方法 罗丹明B与尼古丁均为脂溶性，故以罗丹明B代之。制备含有10 g·L-1罗丹明B的二元醇脂质体及二元醇脂质体温敏凝胶，均匀涂抹于去毛的小鼠皮肤，12 h后，处死小鼠，剥离小鼠皮肤，放于载玻片，备用[12-13]。

2.6.2共聚焦激光扫描显微镜观测 共聚焦激光扫描显微镜对载玻片上的备用皮肤进行断层扫描 。结果见图2。

由图2可知，二元醇脂质体(A)及二元醇脂质体温敏凝胶(B)均可携带药物进入皮肤，图A透皮深度比图B强，但图B皮内滞留量比图A多，这可能是由于二元醇脂质体温敏凝胶有更好的缓释作用，在12 h体外释放量仅为(35.3%±0.26%)，而二元醇脂质体此时释放量(58.40%±0.25%)明显高于二元醇脂质体温敏凝胶。

图2 含罗丹明B二元醇脂质体(A)和二元醇脂质体温敏凝胶(B)的共聚焦激光扫描图

2.7 二元醇脂质体温敏凝胶稳定性及皮肤刺激性

2.7.1二元醇脂质体温敏凝胶稳定性考察 将制备的二元醇脂质体温敏凝胶分别置于冰箱(4 ℃)及室温下，每月测定其胶凝温度及尼古丁含量，不间断测定3 个月[14-16]，在2 种贮存条件下，其胶凝温度及尼古丁含量未发生明显改变，表明二元醇脂质体温敏凝胶稳定性良好[14-15]。结果见表5。

表5 3个月稳定性实验结果

2.7.2二元醇脂质体温敏凝胶皮肤刺激性考察 30只家兔，剪去背部皮肤，10只为对照组，另20只为实验组[17-19]。实验组兔脱毛的皮肤上涂抹固定剂量的二元醇脂质体温敏凝胶。对照组当日处死，取背部皮肤，甲醛溶液(100 g·L-1)固定，脱水，HE染色，制成组织切片，显微镜下观察。实验组给药后24、48 h，处死，取背部皮肤，同上处理后制成切片[20]，显微镜下观察，与对照组相比，实验组皮肤角质层无明显增厚，基底层细胞并未液化变性，表明尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶对皮肤无刺激性，是安全可靠的经皮给药制剂。结果见图3。

注：A 对照组；B 涂抹凝胶后24 h实验组；C 涂抹凝胶后48 h实验组。

3 结论

本实验以接近人体温度(32 ℃)为考察指标，采用单因素实验对处方进行优化，结果表明，尼古丁二元醇脂质体加入量、P188及P407比例分别为3 mL、3.0%及30%时，制备的尼古丁二元醇脂质体温敏凝胶室温下为液体，在体温下为凝胶，易于给药。体外累积释放实验及共聚焦激光扫描图表明，制备的尼古丁二元醇脂质体凝胶具有明显的缓释作用，使药物的作用时间明显延长，大大增加了药物的生物利用度。