异泽兰黄素通过DCST1-AS1/miR-138-5p对胰腺癌细胞SW-1990的影响

程德刚 李福昌 任刚

中药是一种强有效的辅助治疗手段，可用于临床治疗胰腺癌，其作用机制有待更深入的研究[1]。异泽兰黄素是从菊科蒿属植物中分离的一种黄酮苷元，具有抗炎，抗氧化，抗肿瘤等多种药理活性[2,3],可抑制miR-21的表达，通过激活AKT通路诱导肾癌786-O细胞凋亡[4],可通过靶向Akt /GSK3β和MAPK/ERK信号级联反应来抑制食管癌TE1细胞增殖[5],可通过抑制ERK通路抑制肝癌细胞SK-HEP-1增殖以及促进其凋亡[6]。然而异泽兰黄素对胰腺癌细胞SW-1990生物学行为的影响及机制尚不清楚。研究报道miR-138-5p上调可抑制胰腺癌细胞的增殖和转移[7]。lncRNA MCM3AP-AS1通过调节miR-138-5p促进胰腺癌细胞的生长和迁移[8]。生物学软件预测发现miR-138-5p与lncRNA DCST1-AS1有结合位点，DCST1-AS1可促进胶质母细胞瘤细胞的增殖[9]。抑制DCST1-AS1可通过增加miR-874-3p表达抑制子宫颈癌细胞的增殖，迁移和侵袭[10]。因此，本实验旨在研究异泽兰黄素对胰腺癌细胞SW-1990生物学行为的影响及机制是否与DCST1-AS1和miR-138-5p有关。

1 材料与方法

1.1 实验材料 胰腺癌细胞SW-1990(美国ATCC)；RPMI-1640完全培养基(武汉Procell)；异泽兰黄素(HPLC≥98%，滁州仕诺达生物)；CCK-8试剂盒(武汉博士德生物)；吉萨姆染色液(上海钰博生物)；Transwell小室、基质胶(美国康宁)；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、蛋白提取试剂盒(上海贝博生物)；荧光定量PCR试剂盒(德国Qiagen)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(上海碧云天)。

1.2 细胞处理与分组 胰腺癌细胞SW-1990用RPMI-1640完全培养基培养，取对数生长期细胞，分别用2.5 μmol/L、10 μmol/L、40 μmol/L异泽兰黄素处理，记为异泽兰黄素2.5、10、40 μmol/L组，常规培养的细胞作为对照组；将DCST1-AS1抑制表达载体及阴性对照转染至SW-1990细胞，记为si-DCST1-AS1组、si-NC组；将DCST1-AS1过表达载体染至SW-1990细胞后用40 μmol/L异泽兰黄素处理，记为异泽兰黄素+pcDNA-DCST1-AS1组。

1.3 CCK-8检测细胞活性 各组细胞培养48 h，每孔加入10 μl CCK-8试剂，孵育2 h，酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值(OD)。

1.4 平板克隆形成实验检测集落形成数 将各组细胞消化后以适宜浓度接种于6孔板中，约培养2周有肉眼可见克隆时停止培养，吸去培养液后用PBS将细胞洗涤2遍，甲醇固定，吉姆萨染色 30 min，干燥后在光学显微镜下计数>50个细胞的集落。

1.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭 用无血清培养液饥饿细胞12 h，然后制备细胞悬液；将200 μl细胞悬液加入 Transwell 上室，下室加入600 μl含血清培养液，常规培养24 h，取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用PBS洗2遍，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，甲醛固定30 min，将小室适当风干；用0.1%结晶紫染色30 min，用PBS洗3遍；风干后倍显微镜下随机选取5个视野观察，记数。侵袭实验：基质胶稀释后平铺于 Transwell 上室，凝固后同迁移操作。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡 收集各组细胞，用预冷的PBS漂洗2次，加入结合缓冲液重悬，加入10 μl的Annexin V-FITC，再加入5 μl的PI，混匀避光孵育10 min；上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.7 Western blot法检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜、封闭，加入Cleaved-caspase3一抗(1∶500)于4℃孵育过夜，倒掉一抗，洗膜，加入HRP标记的二抗(1∶3 000)，室温摇床孵育2 h，洗膜，显影，分析蛋白条带灰度值。

1.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测DCST1-AS1和miR-138-5p的表达水平 提取各组细胞总RNA，合成cDNA，按照荧光定量PCR试剂盒说明进行PCR，相对表达量用2-△△Ct法计算。分别以GAPDH和U6为内参，DCST1-AS1上游引物序列：5’-CGGTTTTCTCCTCA

GCTTTG-3’，下游引物序列：5’-CCCATGTTTGGGGAT

AGATG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-ATTCCATGGC

ACCGTCAAGGCTGA-3’，下游引物序列：5’-TTCTCCA

TGGTGGTGAAGACGCCA-3’；miR-138-5p上游引物序列：5’-TGCAATGGGTTTGGCGTAGAAC-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCCGCAGGGTAGGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.9 双荧光素酶报告实验 将DCST1-AS1野生型和突变型荧光素酶载体分别与miR-NC或miR-138-5p共转染至SW-1990细胞，按照试剂盒说明检测SW-1990细胞的荧光素酶活性。

2 结果

2.1 异泽兰黄素对SW-1990增殖凋亡迁移侵袭的影响 与对照组比较，异泽兰黄素2.5、10、40 μmol/L组SW-1990细胞活性降低，集落形成数、迁移和侵袭细胞数减少，细胞凋亡率及Cleaved-caspase3表达水平升高，呈浓度依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1，表1。

图1 异泽兰黄素诱导SW-1990凋亡；A 异泽兰黄素诱导SW-1990凋亡；B 异泽兰黄素促进SW-1990中Cleaved-caspase3蛋白的表达(1 对照组；2 异泽兰黄素2.5 μmol/L组；3 异泽兰黄素10 μmol/L组；4 异泽兰黄素40 μmol/L组)

表1 异泽兰黄素抑制SW-1990增殖迁移侵袭诱导凋亡

2.2 异泽兰黄素对SW-1990中DCST1-AS1、miR-138-5p表达的影响 与对照组比较，异泽兰黄素2.5、10、40 μmol/L组SW-1990细胞中DCST1-AS1表达水平降低，miR-138-5p表达水平升高，呈浓度依赖性(P<0.05)。见表2。

表2 异泽兰黄素对SW-1990中DCST1-AS1、miR-138-5p表达的检测

2.3 DCST1-AS1靶向miR-138-5p Starbase预测显示DCST1-AS1和miR-138-5p有互补序列；wt-DCST1-AS1与miR-138-5p共转染的细胞荧光素酶活性低于wt-DCST1-AS1与miR-NC共转染的细胞(P<0.05)；而mut-DCST1-AS1与miR-138-5p或miR-NC共转染的细胞荧光素酶活性无差异(P>0.05)。见图2，表3。

图2 DCST1-AS1和miR-138-5p的互补序列

2.4 沉默DCST1-AS1对SW-1990增殖凋亡迁移侵袭的影响 与si-NC组比较，si-DCST1-AS1组DCST1-AS1表达水平降低，miR-138-5p表达水平升高，SW-1990细胞活性降低，集落形成数、迁移和侵袭细胞数减少，细胞凋亡率及Cleaved-caspase3表达水平升高(P<0.05)。见图3，表4。

表3 双荧光素酶报告实验

图3 沉默DCST1-AS1诱导SW-1990凋亡；A 沉默DCST1-AS1诱导SW-1990凋亡；B 沉默DCST1-AS1促进SW-1990中Cleaved-caspase3蛋白的表达(1 si-NC组；2 si-DCST1-AS1组)

2.5 过表达DCST1-AS1对异泽兰黄素处理的SW-1990增殖、凋亡、迁移侵袭的影响 与异泽兰黄素组相比，异泽兰黄素+pcDNA-DCST1-AS1组DCST1-AS1表达水平升高，miR-138-5p表达水平降低，SW-1990细胞活性升高，集落形成数、迁移和侵袭细胞数增加，细胞凋亡率及Cleaved-caspase3表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。上述指标在对照组与异泽兰黄素组间亦均有差异(P<0.05)。见图4，表5。

表4 沉默DCST1-AS1抑制SW-1990增殖迁移侵袭诱导凋亡

图4 过表达DCST1-AS1可逆转异泽兰黄素对SW-1990凋亡的诱导作用；A 过表达DCST1-AS1可逆转异泽兰黄素对SW-1990凋亡的诱导作用；B 过表达DCST1-AS1可逆转异泽兰黄素对SW-1990中Cleaved-caspase3表达的促进作用(1 对照组；2 异泽兰黄素组；3 异泽兰黄素+pcDNA-DCST1-AS1组)

表5 过表达DCST1-AS1可逆转异泽兰黄素对SW-1990增殖、迁移、侵袭、凋亡的作用

3 讨论

黄酮类化合物具有抗氧化性，抗病毒，抗肿瘤等多种生物活性，开发抗肿瘤的含黄酮类中药对治疗各种癌症具有重要意义[11]。异泽兰黄素作为一种重要的黄酮类活性成分，研究报道异泽兰黄素通过促进HeLa和Caski宫颈癌细胞株的凋亡和细胞周期阻滞来抑制增殖[12]。异泽兰黄素可促进上皮性卵巢癌的细胞凋亡[13]，可抑制神经胶质瘤的增殖，迁移和侵袭[14]，可通过调节PTEN和NF-κB信号传导抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移[15]。本实验用不同浓度的异泽兰黄素的处理胰腺癌细胞SW-1990，结果显示，SW-1990细胞的活性降低，集落形成数、迁移和侵袭细胞数减少，细胞凋亡率及Cleaved-caspase3表达水平升高，呈浓度依赖性；表明异泽兰黄素可浓度依赖性的抑制SW-1990细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡。

研究报道DCST1-AS1通过靶向miR-605-3p来调节胃癌细胞的增殖，迁移，侵袭和凋亡[16]。DCST1-AS1通过AKT/mTOR信号通路加速肝癌细胞的增殖，转移和自噬[17]。本实验结果显示，沉默DCST1-AS1后，SW-1990细胞活性降低，集落形成数、迁移和侵袭细胞数减少，细胞凋亡率及Cleaved-caspase3表达水平升高；表明沉默DCST1-AS1可抑制SW-1990细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡；提示DCST1-AS1在胰腺癌中作用与在其他癌症中相似。且本实验发现DCST1-AS1靶向调控miR-138-5p；而上调miR-138-5p水平可抑制胰腺癌细胞增殖，迁移和侵袭[18]。提示，DCST1-AS1可通过调控miR-138-5p影响胰腺癌细胞生物学行为。此外，本实验发现异泽兰黄素可降低DCST1-AS1表达水平降低，提高miR-138-5p表达水平；而过表达DCST1-AS1可逆转异泽兰黄素对SW-1990细胞的作用。

综上所述，异泽兰黄素通过调控DCST1-AS1/miR-138-5p轴抑制胰腺癌细胞SW-1990的恶性生物学行为。