苗药黑骨藤种子育苗萌发因素筛选及优化

龙金兰 吴之坤

贵州中医药大学，贵阳 花溪 550025

黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr.)为萝藦科(Asclepiadaceae)杠柳属(Periploca)植物，植物名为黑龙骨[1]，药材名为黑骨藤[2]。该植物多生长于海拔2000 m以下的山地疏林向阳处、阴湿的杂木林下或灌木丛中[1]，一般缠绕在周边乔木、灌木或者高大的草本植物上。目前，以黑骨藤为主要原料的药物黑骨藤追风活络胶囊已研发并投入市场，在治疗风寒湿痹、腰腿疼痛等疾病方面有很好的疗效。随着野生资源的大量使用，导致黑骨藤野生资源面临匮乏的危机，因此开展黑骨藤野生变家种的研究工作显得尤为紧迫。近年来有关黑骨藤的研究主要集中在化学成分、药理作用、质量控制及评价等方面，而在其繁育方面未做详细的研究。黑骨藤为多年生的藤本植物，其主要繁殖方式为有性繁殖，但有关其种子生物学方面的研究未见报道。本研究针对黑骨藤的种子进行萌发试验，考察种子萌发消毒条件、萌发基质、温度和光照等不同萌发因素的影响，筛选及优化黑骨藤萌发的最佳条件，以期为黑骨藤的野生变家种及可持续开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料 黑骨藤成熟种子采集于贵阳市乌当区香纸沟(H 1017.61 m；N 26°46′26.90″；E 106°55′12.16″)，果实采集后放置于自然通风处及时晾干，人工剥出种子，去除种毛及杂质，选取颗粒饱满的种子，放置于4 ℃的短期种子库中保存，为后续实验做好准备。实验所用材料经贵州中医药大学鉴定教研室主任吴之坤副教授鉴定为萝藦科杠柳属植物黑骨藤(Periplocaforrestii)的种子，其凭证标本(凭证标本号：HGT201129002)存放于贵州中医药大学中药材种植(养殖)及加工研究所。

1.2 仪器与试剂 仪器：RQX-400B、RQX-400G、RQX-300型人工智能培养箱(常州市华普达教学仪器有限公司)、AUW120D型十万分之一天平[岛津仪器(苏州)有限公司]、游标卡尺、XTZ-E型体式显微镜(上海光学仪器一厂)、Paola2053型解剖刀、BOXUN型立式压力蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)、培养皿(直径15 cm)、镊子、烧杯、纱布、滤纸(15 cm)、脱脂棉、河沙等实验室常用仪器设备及耗材。试剂：75%乙醇、0.1%高锰酸钾和5%次氯酸钠分别以批号为20201214无水乙醇(天津市鑫铂特化工有限公司)、20210103高锰酸钾(重庆川江化学试剂厂)、20210523次氯酸钠(天津市北辰方正试剂厂)与灭菌水配置而成。

1.3 实验方法

1.3.1 种子消毒条件的选择 取黑骨藤种子，用蒸馏水冲洗种子表面污物，用滤纸吸干，再用干净的纱布包好放置备用。随机选取洗净且饱满的黑骨藤种子，用不同消毒方法[3](0.1%高锰酸钾、5%次氯酸钠、75%乙醇)分别对黑骨藤种子进行表面消毒后，放置在铺有湿润滤纸的培养皿中，置于人工智能培养箱中进行萌发实验，重复3次，每次重复30粒种子，观察种子霉烂及萌发情况并记录，从而选择最佳的消毒处理方法。

1.3.2 萌发基质的选择 用5%次氯酸钠消毒后的黑骨藤种子置于铺有润湿的纱布、滤纸、脱脂棉和河沙4种不同基质的培养基中，放在已设置温度、光照等的智能人工气候箱中培养，每个萌发基质平行操作3组，每组30粒，观察各基质种子的萌发情况并如实记录每日种子萌发数，选择最适宜的萌发基质。

1.3.3 光照条件的选择 在消毒条件、基质、温度等萌发条件一定的条件下，对黑骨藤的种子进行全黑暗、光照10 h/14 h、光照12 h/12 h、光照16 h/8 h和全光照5种光照处理，将已消毒的种子放入有润湿基质的培养皿中，置于智能培养箱内观察不同光照处理对黑骨藤种子萌发的影响，每种处理3组平行操作，每组30粒，观察各处理种子的萌发情况并如实记录每日种子萌发数，以此对光照条件进行选择。

1.3.4 萌发温度的选择 在消毒条件、基质、光照等一定的条件下，将已消毒的黑骨藤种子放入已润湿基质的培养皿中，分别置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃ 4个温度的培养箱内培养，观察各温度条件下种子的萌发状况，每种温度重复3次，每次重复30粒种子。

注：萌发标准为胚根突破种皮1 mm以上，萌发结束标准以连续3～5 d萌发数值不再增加即停止实验，记录数据并且计算发芽势和萌发率等。

1.4 指标测定 发芽势(S，%)=n/N×100%，式中：n为发芽高峰期发芽的种子数，N为供试种子总数；

萌发率(F，%)=Z/N×100%，式中：Z为试验结束后萌发种子的总粒数，N为供试种子总数；

发芽指数[4-5]=ΣGt/Dt，式中：Gt为在时间t天发芽的种子数，Dt为相应的发芽天数；

萌发时滞[6]：从萌发试验开始到第 1 粒种子开始萌发所需要的天数；

萌发历期[6]：从萌发试验开始到结束萌发需要的天数。(结束萌发以萌发数不再增加的第1天为计)。

1.5 数据处理试验 数据采用 Microsoft Excel 软件进行统计，用SPSS 23 软件进行单因素方差分析，比较不同处理之间的差异性。

2 结果与分析

2.1 不同消毒条件对黑骨藤种子萌发特性的影响 通过采用不同消毒条件对其进行处理，萌发结束后统计各项萌发指标及分析(表1)，发现以5%次氯酸钠进行种子消毒处理的发芽势最高，高达60%以上，显著高于采用0.1%高锰酸钾处理(P<0.05)，极显著高于采用75%乙醇处理(P<0.01)。并且该条件下，种子萌发率最高(97.78%)，比0.1%高锰酸钾、75%乙醇处理的分别高出3.34%、91.11%；采用0.1%高锰酸钾处理比75%乙醇处理的高出77.77%。75%乙醇与5%次氯酸钠、0.1%高锰酸钾之间的萌发率都具有极显著的差异性(P<0.01)。

黑骨藤种子在萌发过程中，会出现霉烂的情况，通过统计其结果(表1)，可知采用0.1%高锰酸钾处理的发霉率最低，而75%乙醇处理的发霉率最高，比0.1%高锰酸钾、5%次氯酸钠处理的分别高出5.56%、4.45%。

发芽指数能体现出种子的活力潜能[6]，通过统计其结果并分析，在不同消毒处理下，可知采用5%次氯酸钠处理的发芽指数最大，比0.1%高锰酸钾、75%乙醇处理的分别高出6.61%、24.4%。5%次氯酸钠与75%乙醇之间的黑骨藤种子的发芽指数差异性极显著(P<0.01)。由此可见，采用5%次氯酸钠处理对种子的活力促进作用最好。

通过统计其结果(表1)，可知采用0.1%高锰酸钾处理的萌发时滞最短，比5%次氯酸钠、75%乙醇处理的萌发时滞分别缩短2.34 d、7.34 d，且5%次氯酸钠、0.1%高锰酸钾与75%乙醇处理的黑骨藤种子之间的萌发时滞有极显著差异(P<0.01)。采用5%次氯酸钠处理的萌发历期最短，比0.1%高锰酸钾、75%乙醇处理的萌发历期分别缩短5 d、4 d。

综上分析，5%次氯酸钠消毒效果更好且能明显促进种子萌发，故选择5%次氯酸钠作为黑骨藤种子萌发的最佳消毒条件。

表1 不同消毒条件对黑骨藤种子萌发特性的影响

2.2 不同萌发基质对黑骨藤种子萌发特性的影响 由表2可知，以河沙为萌发床的发芽势最高，为53.33%，但其发霉率最高，高达6%以上，发芽指数最低(27.73)，说明以河沙作为萌发床对萌发的促进作用不大；其次是滤纸，为50.00%，其发芽指数最高(30.41)，对种子的萌发有明显的促进作用；纱布发芽势最低，为42.22%。不同萌发基质间的萌发率，以脱脂棉和滤纸为萌发床的种子萌发率最高，均达92%以上，纱布的萌发率最低(87.78%)。

从萌发时滞和萌发历期的角度分析，滤纸和脱脂棉两种萌发基质的萌发时滞最长，均为5.33 d，纱布的萌发时滞最短，为4.33 d；滤纸和脱脂棉的萌发历期最短，均在17 d左右，而纱布的萌发历期最长，达20 d以上。经多重比较分析，4种萌发基质之间的萌发率、发霉率、发芽指数、萌发时滞和萌发历期均不具有显著差异(P>0.05)，而河沙与脱脂棉、纱布之间的发芽势和发霉率之间具有显著差异(P<0.05)。

综合分析：脱脂棉和滤纸在萌发率、萌发时滞和萌发历期上无显著差异，从发霉率和萌发效果上比较，脱脂棉较滤纸发霉率低，且种子萌发效果好，苗的根系发达，茎粗壮，故而选择脱脂棉作为黑骨藤种子的萌发床。

表2 不同萌发基质对黑骨藤萌发特性的影响

2.3 不同光照条件对黑骨藤种子萌发特性的影响

2.3.1 不同光照条件对黑骨藤种子发芽势、萌发率及发霉率的影响 由图1 A可知，在不同光照条件处理下，随着光照时间的增加，黑骨藤种子的发芽势、萌发率和发霉率均呈先下降后升高又下降的变化趋势。全黑暗的发芽势和萌发率均最高，分别为73.33%、96.67%。其发芽势与光照10 h、光照12 h、光照16 h、全光照4种光照条件处理的发芽势相比分别上升了58.89%、27.77%、13.33%、24.44%；萌发率与光照10 h、光照12 h、光照16 h、全光照相比分别上升了2.23%、7.78%、1.11%、5.56%；且除全光照与光照12 h之间的发芽势无显著性差异外(P>0.05)，其余两两比较均具有极显著差异(P<0.01)，不同光照处理间萌发率差异均未达显著水平。光照10 h处理的发霉率为零，与全黑暗、光照12 h、光照16 h、全光照相比分别降低了1.11%、11.1%、6.67%、3.33%，且各处理间发霉率均无显著差异(P>0.05)。由此可见，光照会对黑骨藤种子前期的萌发有抑制作用，也可能诱发种子的霉烂；但适宜光照时间能促进黑骨藤种子的萌发，对种子的萌发芽的长势有促进作用。

通过观察发现，全黑暗处理的幼苗须根较多，主根较弱，幼苗植株根茎细且长，光照条件下幼苗矮壮，根茎较粗。对不同程度的光照时间进行了筛选，发现光照时间为 16 h 时，种子的萌发较快且幼苗粗壮。

2.3.2 不同光照条件对黑骨藤种子发芽指数的影响 由图1 B可知，在不同光照条件处理下，全黑暗的发芽指数最高(38.73)；其次是光照12 h(27.55)、全光照(27.92)、光照16 h(27.17)，光照10 h的发芽指数最低，为22.35。通过两两比较结果分析，全黑暗与光照10 h、光照12 h、光照16 h和全光照的发芽指数之间具有极显著差异外(P<0.01)，其余4种光照条件处理的黑骨藤种子发芽指数均无显著性差异(P>0.05)。由此可见，光照对种子对黑骨藤的种子活力有一定的抑制作用。

2.3.3 不同光照条件对黑骨藤种子萌发时滞和萌发历期的影响 由图1 C可知，在不同光照条件处理下，全黑暗处理的黑骨藤种子萌发时滞最短(2 d)，与光照10 h、光照12 h、光照16 h和全光照处理的黑骨种子萌发时滞差异显著(P<0.01)；其次是光照10 h处理的，萌发时滞为4.33 d，与全黑暗相比延长了2.33 d，而与全光照、光照12 h和光照16 h处理，黑骨藤种子萌发时滞分别缩短 1 d、0.67 d、2 d，且5种光照条件处理的萌发时滞之间均无显著性差异(P>0.05)。

全黑暗处理的黑骨藤种子萌发历期最短(18.33 d)，与光照10 h和光照16 h、光照12 h、全光照相比分别缩短了5 d、4 d、3.67 d；光照 10 h、光照16 h处理的黑骨藤种子萌发历期最长，均为23.33 d，且5种光照条件处理的萌发历期之间均不具有显著性差异(P>0.05)。

综合结论：虽然全黑暗处理下黑骨藤种子的发芽势、萌发率、发芽指数很高，萌发时滞和萌发历期短，苗长势高，但苗的根及茎干均不够发达、不够粗壮，苗较脆弱；通过综合分析，在有光照的条件下，选择发芽势、萌发率高，发霉率低且幼苗粗壮健康，光照16 h处理作为黑骨藤种子萌发的最适宜光照条件。

图1 不同光照处理对黑骨藤种子萌发特性的影响图

2.4 不同温度处理对黑骨藤种子萌发特性的影响

2.4.1 不同温度处理对黑骨藤种子发芽势、萌发率及发霉率的影响 由图2 A可知，在不同温度条件处理下，随着温度的升高，黑骨藤种子的发芽势呈逐渐升高的变化趋势，在30 ℃条件下的黑骨藤种子发芽势最高，高达54.44%，除30 ℃与25 ℃处理的黑骨藤种子发芽势之间有显著差异外(P<0.05)，各处理间的发芽势两两比较均具有极显著差异性(P<0.01)。

在不同温度条件处理下，随着萌发温度的升高，黑骨藤种子的萌发率呈逐渐上升后下降的变化趋势。在25 ℃温度条件下，黑骨藤种子的萌发率最高，高达95%以上，与15 ℃、20 ℃、30 ℃相比分别上升了85.56%、3.34%、5.56%，且除与 20 ℃、30 ℃处理差异不显著性外(P>0.05)，15 ℃与20 ℃、25 ℃、30 ℃处理的差异均达极显著差异(P<0.01)。

在不同温度条件处理下，随着温度的升高，黑骨藤种子的发霉率呈先升高后降为零又升高的变化趋势。15 ℃和25 ℃的发霉率均为0，而30 ℃的发霉率最高(10%)。除30 ℃处理外，15 ℃、20 ℃和25 ℃发霉率之间均不具有显著性差异(P>0.05)。

2.4.2 不同温度处理对黑骨藤种子发芽指数的影响 由图2 B可知，在不同温度条件下，黑骨藤种子的发芽指数与温度呈正相关，在15 ℃处理下，黑骨藤种子的发芽指数达最低(2.06)，与20 ℃、25 ℃、30 ℃处理之间差异均达极显著水平(P<0.01)。由此可知，温度升高对骨藤种子的活力有促进作用。

2.4.3 不同温度处理对黑骨藤种子萌发时滞和萌发历期的影响 由图2 C可知，在不同温度条件处理下，黑骨藤种子的萌发时滞和萌发历期均呈逐渐缩短，25 ℃与30 ℃萌发时滞相同(5.33 d)，25 ℃条件下，黑骨藤种子在第5天便开始萌发，在第19天萌发数便开始不在增加。各温度条件处理之间的萌发时滞和萌发历期均不具有显著性差异(P>0.05)。

通过分析发现，黑骨藤种子萌发的最适温度区间在20～30 ℃之间。但25 ℃温度下对种子萌发的促进能力较好，且种子霉变率低，故选择25 ℃作为黑骨藤种子萌发的最适温度。

图2 不同温度处理对黑骨藤种子萌发特性的影响图

3 结论与讨论

种子在萌发过程中，长时间的水分浸润下，会出现发霉腐烂的情况，选择一种合适的种子消毒方法就显得尤为重要。本研究结果表明，黑骨藤种子最佳的消毒条件为采用5%次氯酸钠浸泡消毒8 min，其能起到良好的消毒效果且能促进种子的萌发。

不同萌发基质对种子的萌发有一定影响[7]，本研究结果表明，采用不同的萌发基质，对黑骨藤种子的萌发有显著影响，保水性强的萌发床更适于黑骨藤种子的萌发，其中以滤纸和脱脂棉的萌发率最高。研究显示，滤纸和纱布都可作为黑骨藤种子萌发的基质，但通过发霉率及萌发效果比较，采用脱脂棉作为萌发床，发霉率低，水分保持状况良好且萌发效果好，幼苗茎干粗壮，根系发达，故最终选择脱脂棉作为最佳的萌发基质。

温度是种子萌发所需的一个极为重要生态条件，它在种子萌发过程中起着重要的作用，是影响种子萌发的主导因子[8]。本研究对温度条件进行考察，结果表明温度对黑骨藤种子的萌发有极为显著的影响，为黑骨藤种子萌发的关键因素。本试验通过对萌发温度的筛选，认为最适黑骨藤种子萌发的温度为25 ℃。在25 ℃条件下，种子的发霉率低，萌发率高，且种苗长势粗壮。

光照也是影响种子萌发的一个重要生态因子。本研究结果表明，在适宜的萌发基质和温度条件下，从萌发率的角度看，黑骨藤种子在萌发过程中，不采用光照萌发率最高，其对光的需求不强，但从综合萌发效果等生长指标分析，不同光照时间对黑骨藤种子的萌发均有一定程度的影响，其最适的光照时间为光照16 h/黑暗8 h。选择合适的光照时长，对种子的萌发起着重要的促进作用。

本研究首次对消毒条件、萌发基质、萌发所需光照及温度等条件对黑骨藤种子萌发进行了单因素考察，最终通过试验得出了黑骨藤种子萌发的最适萌发条件，即采用5%次氯酸钠浸泡消毒8 min，萌发基质为脱脂棉，光照条件为光照16 h/黑暗8 h，萌发温度为25 ℃。由此为后期的黑骨藤种子萌发实验提供了参考。