注射恩诺沙星对中华鳖组织的病理损伤研究

文/张永刚 丁慧平 王政 李兆新 邢丽红 吴薇 刘莹

本文研究了肌肉注射不同剂量恩诺沙星，对中华鳖肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肠道、肌肉、睾丸和精巢的影响。结果显示，2.5mg/kg剂量对各组织器官无明显影响，7.5mg/kg剂量组细胞结构开始出现损伤变化，12.5mg/kg剂量组肝细胞液泡化，脾脏与肾脏组织结构松散，精巢和睾丸生精细胞凋亡，肠细胞溶解，心脏淤血，肌纤维间扭曲。由结果可知，肌肉注射高剂量恩诺沙星可严重影响中华鳖机体内环境，对机体组织造成严重损伤，在疾病防控时需严格遵照推荐剂量给药。

中华鳖（）又名水鱼、团鱼，是一种名贵且经济价值很高的淡水养殖动物，因其具有营养价值和药用价值等诸多优点，被广泛养殖于亚洲多个国家。《2021中国渔业统计年鉴》显示，2020年我国鳖的养殖总产量达到33.3万t，比上一年增长了2.25%。近年来，中华鳖养殖迅猛发展，随着养殖密度增加，养殖水环境恶化，细菌大量繁殖，各种疾病问题也接踵而至。中华鳖疾病相关研究显示，养殖过程中最常发的是细菌性疾病。病原学研究表明，其重要致病原达17余种，如鼠伤寒沙门氏菌（）、迟缓爱德华氏菌（）、嗜水气单胞菌（）、豚鼠气单胞菌（）等，影响中华鳖养殖产业的健康发展。

恩诺沙星（Enrofloxacin，ENR）属于第三代喹诺酮类药物，因其对革兰氏阳性、阴性菌具有良好的抑菌杀菌效果，且毒副作用小，与其他抗生素无交叉耐药性等优点，在陆生、水生及爬行动物的疾病防控过程中被广泛应用。但在养殖过程中过度使用药物、滥用药物及残留药物的无效处理，会对人类健康和生态环境安全构成潜在威胁。已有研究表明，ENR在一定剂量下具有较强的生殖毒性、细胞毒性和免疫活性抑制作用，甚至可影响微生物、藻类的生理功能。目前，关于ENR在虹鳟（）、金头鲷（）、大西洋鲑鱼（）、海鲈（）等水产动物上的药物代谢动力学或毒性的研究已有较多报道，但关于ENR对中华鳖（两栖动物）的毒性研究鲜有报道。

抗生素类药物在临床使用中通常采用注射、口服、药浴或拌饵等给药方式。给药方式会影响药物的吸收速率和生物利用度。一般而言，药物吸收速率从高到低分别是静脉注射、肌肉注射、皮下组织注射和口服，吸收速率最低的给药方式为药浴。为了保证药物更好地进入机体，减少误差，本试验在水温（26.0±1.0）℃条件下，研究了肌肉注射不同剂量的ENR对中华鳖肝脏、脾脏等8个不同组织器官损伤的病理变化，以期了解不同剂量ENR对机体的毒性，为中华鳖科学用药和疾病防治提供理论基础。

一、材料与方法

（一）试验动物

选取山东省某基地培育的优质中华鳖，体质健壮，行动活泼，无伤残，无畸形，每只规格为（500±50）g。试验前需检测确保其体内无ENR药物残留，给药前停饲24h。

（二）试验设计

以2.5mg/kg为基准，同时设置3倍剂量（7.5mg/kg）和5倍剂量（12.5mg/kg）试验组及1个对照组，每组均设3个平行，每个平行10只中华鳖。试验组采用肌肉注射给药方式，用注射器在大腿外侧肌肉注射药液0.5mL，对照组肌肉注射同等体积的无菌生理盐水。试验共进行3d，肌肉注射1次/d，试验期间水温保持（26.0±1.0）℃。

（三）样品采集与组织切片处理

参照青岛市渔业技术推广站刘莹等的方法，在停药24h后采样，从每个试验组及对照组随机取3只中华鳖于冰盘上解剖，分离出肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肌肉、睾丸和精巢等组织，固定于Davidson’s固定液中，24h后将固定液更换为70%乙醇溶液。然后经无水乙醇梯度脱水（70%、85%、95%）、二甲苯透明（3次）、浸蜡（63℃）、包埋、切片（5μm）、展片、烤片，最后参照Bancroft的方法，将切片用苏木精-伊红（H.E.）染色后，在光学显微镜下进行组织病理学分析。

二、试验结果

（一）肠组织结构观察

对照组与1倍剂量组（图1A、1B）肠绒毛结构清晰，黏膜下层和肌层完整无炎性细胞浸润，未见病理特征；随着注射剂量的增加，3倍剂量组（图1C）肠绒毛结构发生改变，部分绒毛破碎，杯状细胞H.E.染色加深，有淋巴细胞浸润；5倍剂量组（图1D）肠组织结构模糊，细胞溶解，肠绒毛广泛受损，大多数肠上皮细胞已脱离，游离于肠腔。

图1 恩诺沙星对中华鳖肠组织的影响

（二）肝组织结构观察

对照组（图2A）肝小叶轮廓清晰，肝细胞核大而圆，未见病理特征；而1倍剂量组（图2B）小间叶动脉管壁增厚，中央静脉中有部分细胞脱落；随着注射剂量的增加，3倍剂量组（图2C）肝细胞液泡化，细胞质松弛，肝门血管内有大量炎性细胞浸润，肝窦轻微扩张；而5倍剂量组（图2D）肝板结构严重受损，细胞排列紊乱，大量红细胞积聚。

图2 恩诺沙星对中华鳖肝组织的影响

（三）脾组织结构观察

对照组与1倍剂量组（图3A、3B）脾组织红髓和白髓分区明显，细胞排列紧密，未见病理特征。与对照组相比，3倍与5倍剂量组（图3C、3D）脾组织结构松散，受损严重，中央动脉扩张、充血、大量炎性细胞浸润，小梁出血，动脉周围淋巴鞘肿胀。

图3 恩诺沙星对中华鳖脾组织的影响

（四）肾组织结构观察

对照组与1倍剂量组（图4A、4B）肾脏远端小管与近端小管结构明显，各细胞间界限清晰，细胞核完整，未见组织病变；随着注射剂量的增加，3倍剂量组（图4C）细胞结构松散，肾小管管腔内有血铁红素沉积；5倍剂量组（图4D）细胞界限不清，近曲小管管腔变小，有大量炎症细胞浸润。

图4 恩诺沙星对中华鳖肾组织的影响

（五）心组织结构观察

对照组与1倍剂量组（图5A、5B）心肌纤维纵横交叉，排列有序，未有病理变化；随着注射剂量的增加，3倍剂量组（图5C）肌纤维束出现断裂现象，并伴有红细胞浸润；而5倍剂量组（图5D）心脏内大面积淤血，肌纤维束排列紊乱。

图5 恩诺沙星对中华鳖心组织的影响

（六）睾丸组织结构观察

对照组与1倍剂量组（图6A、6B）睾丸切片未见组织结构改变，由曲细精管和间质结缔组织组成生，曲细精管排列规则，其内充斥着不同分化阶段的生精细胞（精原细胞、精母细胞、精子细胞）；随着注射剂量的增加，3倍剂量组（图6C）曲细精管轻度扭曲，生殖细胞轻微脱落（萎缩），精子细胞开始减少；而5倍剂量（图6D）组血管充血明显，睾丸实质内精子细胞大量减少，精子发生明显改变，出现空腔现象。

图6 恩诺沙星对中华鳖睾丸组织的影响

（七）精巢组织结构观察

对照组与1倍剂量组（图7A、7B）无明显组织形态学差异，生精小管结构完整，小管内充斥着大量活跃的精子；随着注射剂量的增加，3倍与5倍剂量组（图7C、7D）间质疏松结缔组织充血，生精小管内生殖细胞严重萎缩、减少，出现空腔现象。

图7 恩诺沙星对中华鳖精巢组织的影响

（八）肌肉组织结构观察

对照组、1倍和3倍剂量组（图8A、8B、8C）肌肉纵切面形态正常，肌纤维平行排列，没有扭曲和断开现象；与对照组相比，5倍剂量组（图8D）骨骼肌出现轻微的形态学变化，肌纤维间扭曲、断开，纵向间隙变大。

图8 恩诺沙星对中华鳖肌肉组织的影响

三、讨论

组织病理学可以直接准确地反映组织和细胞的病理变化，为疾病诊断和临床治疗提供可靠的依据。本试验以肌肉注射的给药方式，探究了注射不同剂量ENR（1倍、3倍、5倍试验基准剂量）对中华鳖组织器官损伤的情况。

组织病理学试验发现，中华鳖肌肉注射中、高剂量（7.5mg/kg和12.5mg/kg）的ENR，可对机体的肝脏、脾脏、肾脏造成不同程度的损伤，其中高剂量组最为严重。主要表现为肝细胞液泡化、大面积凋亡或坏死，脾脏与肾脏组织结构松散、大量炎性细胞浸润。相关研究发现，ENR可诱导草鱼的肝细胞凋亡，并具有显著的剂量依赖性。章宇思等研究表明，连续肌注恩诺沙星对中华草龟具有明显的肝毒性，同时出现肾脏、肌肉坏死，且剂量效应显著。本试验与上述研究结果相一致，但肌肉损伤情况较轻。

卵巢、精巢是动物的性器官，化学药物能在其中积累，可改变其组织结构，进而对其造成遗传毒性。试验结果发现，高剂量肌肉注射ENR对中华鳖的精巢和睾丸组织学有负面影响，ENR对中华鳖产生了生殖毒性。

四、结论

综上所述，在正常注射剂量下，ENR对中华鳖各组织器官无显著影响，但在中、高注射剂量下，ENR对中华鳖肠道、肝脏、脾脏、心脏、肾脏、肌肉、睾丸和精巢均可产生较强的毒性作用，其中以消化、排泄、造血及生殖器官最为严重。与已报道的研究相比，肌肉注射较口服造成的组织损伤轻。因此，在实际养殖过程中，预防和治疗水产养殖动物细菌性疾病时，需要根据动物机体的实际情况选择合适的给药方式，以及合理的给药剂量，以免过度使用药物对动物机体造成损伤。