基于SERS技术对水产中硝基呋喃检测的基底研究

⊙ 文 曾波明 曾莉 抚州幼儿师范高等专科学校

近年来食品中的违规添加现象层出不穷，水产养殖中的硝基呋喃类抗生素就是其中的一种。硝基呋喃是一种抗生素，被用作动物的生长促进剂，还多用于预防和治疗大肠杆菌、沙门氏菌等引起的胃肠道感染。但由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎等副作用，原中国卫生部将其列入违法添加的非食用物质黑名单。

尽管各国已经明确禁止使用硝基呋喃类抗生素，但许多养殖者受利益的驱使，仍然违禁使用此类药物用于治疗水生生物疾病。由于硝基呋喃类抗生素半衰期非常短，在生物的体内代谢快，这为此类药物的检测带来了巨大的困难，所以硝基呋喃类检测技术的研究重点放在了不要衍生化步骤下实现准确测定。因此，研究和开发一种集萃取、富集、分离和检测一体的快速检测技术是未来硝基呋喃类药物检测的发展方向。

表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering，下称 SERS）技术是一种振动光谱分析技术。SERS的产生在大多数情况下必须依赖贵金属（通常是Au、Ag、Cu等），以纳米材料作为信号增强基底。SERS不仅分析速度快（几秒到几分钟），而且灵敏度可达到单分子水平。与红外光谱相比，SERS不仅远超其灵敏度，几乎不存在水分子光谱干扰，而且同样可提供分子指纹信息，可用于物质定性分析。不仅如此，SERS光谱半峰宽仅为1nm左右，可以对多种物质同时进行定性和定量分析而不发生相互干扰。尤为重要的是，拉曼仪器是当前少有的几种可以实现便携而几乎不损失分析性能的光谱分析仪器之一。这些优点奠定了SERS技术作为一种适合痕量及超痕量定性和定量分析方法的基础。现在，SERS技术已经广泛应用于生命医学、环境监测、食品安全，乃至国家安全等领域。鉴于Raman和SERS光谱可提供分子指纹信息，能进行原位表征，其非常适合用于呋喃类抗生素指纹检测，因而开发稳定、高效的基底是SERS技术发挥出其效应的基础。本文使用溴化钾修饰银纳米粒子作为SERS检测技术的基底，用SERS方法获得了不同浓度下呋喃唑酮标准液的光谱，发现其检出限可达到1ppb，检测灵敏度良好。

一、硝基呋喃检测方法和SERS基底合成

由于抗生素屡禁不止，全世界各地在呋喃类抗生素检测方面已有不少研究。目前对硝基呋喃类抗生素的检测方法主要分为色谱法（包括高相液相色谱-紫外、高效液相-荧光、高效液相-二极管阵列、液相色谱-电化学检测器）、分光光度法、酶免疫色谱法、液相色谱-质谱法等。

在目前所有的基底中，SERS的研究者普遍认为，金、银溶胶的稳定性与SERS效果较之其他种类的纳米材料更为理想，制备方法也更为简单。目前，人们已经可以根据实验目的对金纳米粒子的形貌、尺寸、聚集度等因素进行调控，其中核壳结构、分子组装技术成为研究的热点。

二、实验材料及过程

（1）实验主要试剂：呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃西林、乙腈、去离子水、柠檬酸钠、溴化钾等。（2）实验主要仪器：拉曼光谱仪（Pixis-100BR CCD，Acton SP-2500ispectrograph），实验条件：激发波长，632.8nm；物镜，20倍；紫外可见光谱仪（UV-Vis sp-756）；超纯水机Nanopure，Thermo；离心机；旋转蒸发仪（Shen Shun technology R-501）；电子天平（梅特勒-托利多 AL204）；水平振荡器；加热盘（IKA RCT basic）；三频恒温数控超声波清洗器（昆山市超声仪器，KQ-300GVDV）。

本实验主要通过用柠檬酸钠还原硝酸银获得银纳米颗粒，下面简要阐述其制备过程。首先将50mL AgNO（1mM）溶液在快速搅拌下加热至沸腾，然后快速加入1mL配置好的1%柠檬酸钠水溶液。在此基础上，将得到的混合物继续快速搅拌煮沸1h。停止加热但仍然保持快速搅拌直至溶液冷却至室温，此时得到的黄绿色液体即为本实验需要的Ag NPs，其紫外吸收光谱和透射电镜的表征如图1所示。

图1 ：Ag NPs的紫外吸收光谱图（左）和透射电镜图（右）

为了制备Ag-BrNPs，首先需要将1mL上述制备获得的Ag NPs在10000rpm条件下离心10min，然后除去上清液。此时，离心管中剩下的液体大约为10-20μL，将其涡旋震荡1min从而使浓缩后的Ag NPs溶胶更均匀。最后向离心管中滴加15μL的10mM溴化钾水溶液，涡旋震荡1min备用。

准确称取呋喃妥因、呋喃西林和呋喃唑酮标准品各0.01g，分别用10mL乙腈溶解，得到质量浓度为1000ppm（μg/L）的标准储备液，在常温下避光密封保存。将此标准储备液用乙腈逐级稀释成质量浓度分别为100、50、10、5、1、0.5、0.1、0.01、0.001ppm（μg/L）等浓度水平的标准工作溶液，在常温下避光密封保存。

（1）优化卤素离子种类。分别取1mL柠檬酸钠还原制备的1mM的Ag NPs，离心去除上清液后向里面添加15μL 10mM KI（碘化钾）、KCL（氯化钾）和KBr（溴化钾），涡旋震荡1min后取5μL滴加在玻璃片上，然后在相同位置上马上分别滴加5μL 1ppm呋喃唑酮。取1mL柠檬酸钠还原制备的1mM的Ag NPs，离心去除上清液后涡旋震荡1min，取5μL滴加在玻璃片上，然后在相同位置马上分别滴加5μL 1ppm呋喃唑酮。结果显示，用KBr修饰银纳米粒子对呋喃唑酮的SERS响应最好，如图2所示。

图2 ：不同卤素离子修饰Ag NPs对呋喃唑酮的SERS谱图

（2）优化KBr的量。分别取1mL柠檬酸钠还原制备的1mM的Ag NPs，离心去除上清液后向里面添加5、10、15、20、25、30、40、50、80μL 10mM KBr，涡旋震荡1min后取5μL滴加在玻璃片上，然后在相同位置马上分别滴加5μL 1ppm呋喃唑酮。结果显示，当用15μL 10mM KBr修饰Ag NPs对呋喃唑酮的SERS响应最好（如图3所示），因此，15μL 10mM KBr为最佳KBr的量。

图3 ：不同量KBr修饰Ag NPs对呋喃唑酮的SERS谱图（左）及其在1357cm-1处的SERS信号强度对比图（右）

（3）优化反应时间。分别取1mL柠檬酸钠还原制备的1mM的Ag NPs，离心去除上清液后向里面添加15μL 10mM Kbr，涡旋震荡1min后分别放置0、5、10、20、30、60min后取5μL滴加在玻璃片上，然后在相同位置马上分别滴加5μL 1ppm 呋喃唑酮。结果显示，反应时间在1h内，Ag-BrNPs对呋喃唑酮SERS响应都比较好，如图4所示。

图4 ：KBr修饰Ag NPs在不同反应时间对呋喃唑酮的SERS谱图对比图

（1）拉曼检测条件。633nm激光器、激光功率40μw、积分时间10s*5次、光栅1200line、中心线1300、物镜50×镜头。

（2）SERS检测方法。分别取上述制备好的1mL柠檬酸钠还原制备的Ag NPs，按照上述步骤离心去除上清液后向里面添加15μL 10mM KBr，涡旋震荡1min后取5μL滴加在干净玻璃片上，然后在相同位置马上分别滴加5μL不同浓度的呋喃唑酮乙腈溶液。等溶剂挥发后，进行拉曼检测。呋喃唑酮的SERS光谱图如图5所示。

图5 ：呋喃唑酮的SERS谱图

根据文献，SERS的主要峰出现在971、1416和1609cm处，这归因于环C-OC-C拉伸振动模式。1245cm处的峰归属于苯环内CH弯曲振动模式，1357和1570cm处的峰归因于-NO的对称拉伸振动模式。

（3）SERS方法对呋喃唑酮的检出限。用SERS方法获得了不同浓度呋喃唑酮标准液的光谱，发现其检出限可达到1ppb，远低于文献报道（0.1μg/g或者0.1ppm），如图6。

图6 ：呋喃唑酮在不同浓度的SERS谱图

三、结论

现在SERS技术对痕量硝基呋喃的检测日趋成熟，高效快捷的检测有赖于合适的高效基底。因此，如何在实验室快速制备廉价、合适、易组装的基底，是SERS技术在水产检测中发挥出应用效应的核心。