外泌体对卵泡卵母细胞及胚胎发育影响的研究进展

韩 越，李春宇，尹 伊，金 一

（东北寒区肉牛科技创新教育部工程研究中心，延边大学农学院，吉林延吉 133002）

外泌体（Exosomes）是一种由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡，广泛存在于动物血液、卵泡液、尿液、唾液、子宫液和乳汁等各种体液中，其内部包含miRNA、mRNA和蛋白质等多种生物活性物质。外泌体是通过多囊泡内体途径产生的，当多囊泡内体（MVE）与细胞表面融合后，外泌体会通过出芽等方式释放出来，携带这些生物活性物质到其他细胞当中发挥作用，以此实现细胞间的信息交流。此外，外泌体的囊状结构还可以保护其中的内含物，比如避免miRNA降解，保持其生物学稳定性，将其有选择性地运送到相应的靶细胞中并调控相应的靶基因。近年来，研究人员发现外泌体中的内含物可以作为卵巢、子宫等疾病的一种诊断标志物，且在卵母细胞正常发育以及胚胎发育等方面起到调控作用。卵泡液是卵母细胞发育、成熟，保持卵母细胞质量的重要微环境，目前普遍认为分析卵泡液组分可以为卵母细胞质量提供有用的相关信息，而卵泡液中外泌体作为细胞间信息传递的桥梁，了解其中内含物，有利于进一步分析和研究卵母细胞发育的机制。因此本文对卵泡液外泌体在卵母细胞发育和胚胎发育中的研究进行了综述，为进一步深入研究外泌体的相关作用提供参考。

1 外泌体的提取与鉴定

1.1 外泌体的提取方法 外泌体的提取方法包括试剂盒提取法、超速离心法、超滤法、免疫磁珠法和色谱法等。超速离心法是采用低速、高速离心交替进行获取外泌体，该方法目前常与0.22 μm滤过膜结合使用，是最常见的使用方法，操作方法简单，可获得较高纯度的外泌体。试剂盒提取法也逐渐开始应用，但存在可能混杂其他蛋白的问题。超滤法是利用超滤膜提取外泌体，但纯度不高。免疫磁珠法是将包被抗标记物（如CD63蛋白）抗体的磁珠与外泌体孵育后结合获得外泌体，但不利于后续实验。色谱法是根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系分离外泌体，但因其需要特殊的设备所以应用较少。

1.2 外泌体的鉴定方法 外泌体的鉴定方法包括透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子跟踪分析（NAT）和Western印迹等方法。TEM可以直接观察外泌体的大小和形态，但不宜进行大量快速的检测。NAT能够检测外泌体的粒径和浓度，但不能区分外泌体与非外泌体颗粒。Western印迹通过外泌体标志蛋白（如CD9、CD63、CD81等）进行检测，但不同来源的外泌体检测的标志物可能不同。目前这3种方法通常联合使用。

2 外泌体对卵母细胞发育的影响

2.1 卵泡液外泌体对卵母细胞发育的影响 在卵母细胞发育过程中，外泌体携带各种物质进入不同细胞中发挥作用,来协调各种不同细胞之间的联系，从而对卵母细胞的生长、成熟和排卵有着非常重要的作用。

2.1.1 卵泡液外泌体对颗粒细胞的影响 最初卵泡中卵母细胞由单层颗粒细胞包围，随着卵泡生长，颗粒细胞由单层分裂变为多层，当卵泡腔进一步形成，包围在卵母细胞周围的颗粒细胞隆起形成卵丘，称为卵丘细胞，紧贴卵泡壁的颗粒细胞又称为壁颗粒细胞，壁颗粒细胞和卵丘细胞参与调控卵母细胞成熟的过程。猪卵泡液中大部分的外泌体可能来源于壁颗粒细胞，也有一部分可能来源于卵巢其他细胞或者通过血液来源于其他器官的细胞，卵泡液外泌体中大部分mRNA与调节卵母细胞减数分裂、卵母细胞成熟及颗粒细胞增殖（如MAPK-ERK1/2和PI3K-AKT）等信号通路有关，且外泌体能够被颗粒细胞（即壁颗粒细胞）和卵丘细胞摄取，改变与细胞增殖和凋亡相关基因（如和等）的表达，促进颗粒细胞增殖，但不能有效诱导卵丘扩张。Rodrigues，Hung和丁强研究表明，牛和山羊小卵泡液外泌体更有利于颗粒细胞增殖，而且不同大小卵泡卵泡液外泌体都能够诱导卵丘扩张，牛卵泡液外泌体还能够减少热休克对卵裂和胚泡发育的消极影响。这种差异可能是由于物种或者培养条件不同所致，具体原因还有待研究。以上研究说明卵泡液中的外泌体有利于颗粒细胞增殖，虽然对卵丘扩张的研究结果不一致，但颗粒细胞和卵母细胞之间存在缝隙连接，所以外泌体可能通过进入颗粒细胞调节其中成分从而调控卵母细胞的发育。

2.1.2 不同阶段卵泡液外泌体对卵母细胞发育的影响不同阶段卵泡卵泡液在培养卵母细胞中表现出不同效果，可能与其中所含物质不同有关，研究其中的差异物质可以为卵母细胞发育提供参考。在猪中不同直径卵泡卵泡液外泌体miRNA的表达具有差异，且与卵母细胞发育相关的差异miRNA的靶基因主要与TGF-等信号通路有关，其中1～2 mm 小腔卵泡卵泡液（SFF）可提高卵母细胞直径、H4K12乙酰化水平和囊胚率，而外泌体耗竭的情况下抵消了这种增长效果，但囊胚率的减少没有显著变化；miR-17b、-92a、-145是从猪大、小卵泡卵泡液外泌体差异miRNA中筛选出的与卵母细胞质量有关的外泌体miRNA，miR-92a有利于卵母细胞直径增大，增强了H4K12乙酰化水平，miR-17b、-92a、-145增强了染色质凝聚，miR-17b、-92a还提高了体外成熟和激活后囊胚期发育速度。同样马不同卵泡期卵泡液外泌体miRNA也存在差异且主要靶向通路也为TGF-通路。相关研究表明相比于牛4～8 mm完全生长卵母细胞卵泡液外泌体miRNA，在生长卵母细胞组外泌体中上调的miRNA参与泛素介导通路、神经营养蛋白信号通路、MAPK信号通路和TGF-信号通路等，这些通路都与卵母细胞分裂、生长成熟有关。牛3～6 mm卵泡卵泡液外泌体可以显著提高囊胚率。另外胡頲还发现人卵泡液外泌体是影响妊娠的一个因素。以上研究表明在不同阶段卵泡液外泌体中的内含物是有差别的，这可能就是不同大小卵泡卵泡液培养卵母细胞时成熟率或者囊胚率存在差异的原因之一。而且在培养过程中单独添加外泌体miRNA可以提高卵母细胞发育情况，但miRNA对应靶基因不同且数量庞大，所以miRNA的具体作用还有待进一步研究。

2.1.3 卵泡液外泌体对卵母细胞质量的影响 卵母细胞质量直接影响随后的排卵、受精、着床和胚胎发育等关键阶段。年龄和疾病是影响卵母细胞质量的主要因素，因此研究不同年龄、不同健康程度雌性动物卵泡液中外泌体将有利于为选育优质卵母细胞提供参考。不同年龄马的卵泡液外泌体miRNA存在差异，其中在老年母马中差异高表达的3个miRNA（miRNA-181a、miRNA-375和miRNA-513a-3p）的靶向通路是TGF-信号通路，而且在年轻母马中存在抑制素和抑制素-A链前体蛋白。这说明外泌体中内含物与卵母细胞质量相关，在老年母马中差异表达的miRNA还可以作为研究卵母细胞质量的标志物。人卵母细胞质量优良和卵母细胞质量不良卵泡液外泌体的差异miRNA在之前的研究中已有部分表明与卵母细胞发育相关，如miRNA-505-3P过表达导致卵巢成熟延迟、生育力退化；miRNA-320e过表达会抑制颗粒细胞增殖，影响卵泡发育；miRNA-1303过表达与卵巢衰老有关，而其余microRNA虽然目前研究尚少，但其在卵母细胞质量不良卵泡液外泌体中的高表达也说明其可能与卵母细胞质量有关。多囊卵巢综合征（PCOS）是一种女性常见内分泌紊乱性疾病，损伤卵泡内环境，表现出排卵障碍等问题。相关研究表明与非PCOS者相比，在PCOS患者的卵泡液外泌体中存在差异miRNA，而且之前的一些研究中也表明其中的差异miRNA-486-5p与颗粒细胞增殖相关，miRNA-16-5P与卵巢排卵有关。连一凯等研究显示非编码RNA与颗粒细胞增殖、卵泡闭锁和卵泡发育有关。卵巢储备功能下降（DOR）目前也是女性生育能力下降的主要因素。与正常卵巢功能组相比，DOR组卵泡液外泌体中差异表达miRNA的靶基因参与了cAMP和MAPK等通路，而这些通路与卵母细胞发育相关。PCOS和DOR会使卵母细胞受损、影响卵母细胞减数分裂，而上述对健康人员和患者卵泡液外泌体进行的研究也发现存在与卵泡和卵母细胞发育相关miRNA的差异表达，因此分析这些miRNA不仅能提高卵母细胞发育情况，还能够为疾病的研究提供新方向。

2.2 其他来源外泌体对卵母细胞发育的影响 卵泡液对卵母细胞发育至关重要，但其他来源的外泌体也能够影响卵母细胞发育。狗输卵管细胞来源外泌体能够通过EGFR/MAPK信号通路（细胞发育的重要性途径）有效地改善其卵丘细胞的生理作用。人羊水干细胞外泌体（hAFSc-EXO）能够改善化疗导致的大鼠颗粒细胞损伤。小鼠羊水干细胞外泌体（AFSc-EXO）、人脐带间充质干细胞外泌体(HucMSC-exos)和人羊膜间充质干细胞（hAMSC）外泌体均对小鼠卵母细胞发育有影响，其中小鼠AFSc-EXO中高丰富的miRNA-10a有利于防止受损伤的颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁，HucMSC-exos有利于提高老年小鼠卵母细胞的产量和质量，hAMSC-exos的miR-320介导SIRT4信号传导对卵巢功能的影响中起着关键作用。卵泡液中外泌体可能不单单来源于卵巢颗粒细胞的分泌，还有通过血液循环进入的其他来源外泌体，但这些具体来源还有待研究，因此对不同来源外泌体的研究将为进一步研究影响卵母细胞发育的物质提供参考。

3 外泌体对胚胎发育的影响

最近的研究表明，在胚胎发育以及胚胎植入过程中，外泌体可以参与胚胎与母体组织之间的复杂通讯，在胚胎发育发育过程中发挥着非常重要的作用。

3.1 不同妊娠状态外泌体对胚胎发育的影响 人血浆外泌体浓度随着妊娠的进展而增加，且在妊娠期间存在胎盘源外泌体，外泌体胎盘碱性磷酸酶（PLAP）比率在妊娠早期和妊娠中期相似，在妊娠晚期下降，但也发现外泌体PLAP比率在妊娠期间呈现上升趋势。这可能是由于在血浆中分离的外泌体大小不等所造成的。Menon提取血浆外泌体，检测到了<50 nm、50～150 nm、150～200 nm和>200 nm囊泡的浓度，其中只有50～150 nm囊泡浓度持续上升，这说明外泌体提取方法还有待改进，而且不同大小囊泡可能有不同作用。在奶牛血浆中也发现了外泌体和胎盘源外泌体浓度一直呈现上升的趋势，而且在妊娠不同阶段血浆外泌体中存在差异miRNA，与未妊娠相比，在妊娠早期高表达的miRNA参与NF-κB等免疫炎症信号通路，其中miR-499能提高let-7水平抑制NF-kB信号通路从而调节免疫微环境，而子宫免疫微环境对于胚胎发育是必须的。相对于未妊娠山羊来说，妊娠山羊血浆外泌体中存在特意ssa-miR-137-3p和novel miR-736等，这些差异miRNA的靶基因富集在Notch、Wnt和Hippo等与胚胎发育相关的信号通路。以上研究说明在不同物种不同妊娠阶段都存在胚胎源外泌体，且胚胎源外泌体在妊娠阶段联合母体产生的外泌体为胚胎发育提供适宜的环境是不可或缺的。同时在妊娠阶段特意表达的外泌体miRNA或许可以作为诊断妊娠的一个指标。

3.2 外泌体对胚胎生长和着床的影响 滋养层细胞在胚胎植入过程中发挥着非常重要的作用，能够分泌一系列细胞因子和激素使得胚胎对子宫内膜发生黏附和侵入。牛、羊、猪和人的子宫腔液中均含有外泌体。患有子宫内膜炎牛的子宫腔液中分离出的外泌体会降低囊胚发育率，而且子宫内膜上皮细胞衍生(EECs)的外泌体有利于滋养层细胞的迁移和发育，外泌体的miR-218能够恢复子宫内膜炎导致的和基因表达降低，从而对滋养层细胞造成影响。在牛胚胎体外培养过程中发现更换胚胎培养液会导致胚胎产生的外泌体丢失，从而影响内细胞团和滋养层细胞分化影响胚胎发育，相反不换液或者再换液时添加胚胎源外泌体将有利于胚胎后续发育。人EEc外泌体miRNA可通过小鼠滋养外胚层进入胚胎中，且经外泌体的miR-30 d处理后胚胎中与细胞粘附等相关的基因（如ITGB3和ITGA7）表达升高，增加了胚胎黏附能力，有利于胚胎的生长与着床。使用低分子量肝素（LMWH）处理人滋养层细胞能够改变其外泌体miR-18a-3p的含量，进而影响滤泡辅助性T细胞（Tfh）的功能，对复发性流产（RSA）患者提供帮助。还有研究表明羊子宫液外泌体能够进入胚胎滋养层，提高增殖基因，促进胚胎滋养层细胞增殖。猪子宫腔液外泌体的miR-125b可调控胚胎发育和着床过程中关键基因的表达。以上研究说明在胚胎发育过程中外泌体的存在是尤为重要的，不仅有利于胚胎着床，还有利于胚胎发育到足月生产。

3 小 结

随着研究人员对外泌体认知的深入与研究的展开，发现外泌体对卵母细胞成熟、颗粒细胞增殖、受精和胚胎发育等都具有重要的影响，但具体外泌体所携带物质的作用机制仍然需要进一步研究。比如外泌体的具体来源尚未明确；外泌体中mRNA和蛋白等其他成分的研究不足；外泌体miRNA与靶基因之间的验证及机理等研究不充分。总的来说，外泌体对于维持机体各方面功能至关重要，未来需深入研究其作用机理，以期深入了解家畜繁殖性能，促进畜牧进一步发展。