神经生长因子对胫骨骨折大鼠骨力学、骨强度及骨桥蛋白及下游相关因子水平的影响

王晓晨，胡海燕，向继林，谭晓秋

中国每年约有440万人经历过创伤性骨折，且骨折发生率呈上升趋势[1-2]。骨折愈合过程一直受到学者们关注，5%～10%的骨折患者存在骨折愈合不良情况[3]。临床研究[4]发现，神经元损伤可导致骨折断端骨痂过度生长甚至在肌肉中出现异位骨化，说明神经因子对骨折愈合有影响。随着研究的不断深入，神经营养因子促进骨折愈合的作用逐渐得到证实[5]。神经营养因子是一类对神经元的发育、存活和凋亡起重要作用的蛋白质，神经生长因子(NGF)是神经营养因子中被发现最早的，具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调控因子，它对中枢及周围神经元的发育、生长等表达有重要调控作用。已有研究[6-7]证实，NGF通过促进大鼠骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达，诱导成骨细胞增殖，从而促进胫骨骨折愈合。骨桥蛋白(OPN)是一种蛋白质，参与了组织修复、自身代谢等。关于NGF的具体作用机制及对OPN的影响等暂未可知。因此，本实验给予胫骨骨折大鼠NGF，观察其对骨生物力学、骨强度、OPN及下游相关因子水平的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物42只SPF级SD雌性怀孕大鼠，由湖南斯莱克景达实验动物公司提供，动物合格证SCXK(湘)2017-0025，体重270～390(330±120) g。分笼饲养于温度19～25(23±6)℃、湿度45%～50%、12 h明暗交替的实验动物中心。产后24 h内进行实验。实验动物符合《实验动物管理条例》规定，本研究符合四川省骨科医院动物伦理委员会要求。

1.2 仪器、试剂及药物万能材料力学测试机购于济南中路昌试验机制造公司；Hologic型双能X线骨密度仪购于上海企晟医疗器械公司；蛋白电泳仪购于北京德元国际科技公司；一抗、二抗均购于上海高创化学科技有限公司；NGF冻干粉购于武汉益普生物科技公司。

1.3 分组和建模将42只大鼠按照随机数字表法分为生理盐水组(A组)和NGF组(B组)，每组21只。胫骨骨折模型的建立：42只大鼠用2%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位于手术台，固定右下肢，脱毛，常规消毒，在胫骨结节上方2 mm处做长1.5 cm的纵向切口，切开皮肤、皮下组织，暴露上半段胫骨，剥离肌肉，于胫骨结节下1.0 cm处横行切断胫骨，以ø 1 mm克氏针做髓内固定，逐层闭合切口。术后持续3 d给予大鼠肌肉注射共10万U青霉素。

1.4 干预方法建模后第2天，B组每天用2 ml生理盐水稀释NGF并肌肉注射0.2 ml，注射部位为两侧腓肠肌，连用2周。A组以相同的方法肌肉注射等量生理盐水。

1.5 观察指标术后第 1、3、5 周分别从两组中随机各选取7只大鼠麻醉后处死，记录相关观察指标。

1.5.1骨痂大小、骨折愈合情况 摄右侧胫骨骨折处X线片，观察骨痂大小、骨折愈合情况。

1.5.2骨生物力学相关指标 取大鼠右侧胫骨，仔细剔除软组织及关节突起，在不损害骨痂的前提下采用粗砂纸打磨使骨表面平滑。取出“1.3”项目中插入的克氏针，采用万能材料力学测试机检测其3点弯曲生物力学指标。将大鼠的长柱体胫骨放置在试验机支座上以1.0 mm/s的速度给予胫骨骨痂加压力载荷至断裂，测试系统自动记录载荷变形曲线，根据曲线得到胫骨在受弯情况下的最大载荷、弹性载荷和最大挠度等生物力学检测指标。

1.5.3胫骨骨强度相关指标 取大鼠右侧胫骨，采用Hologic型双能X线骨密度仪测量胫骨组织骨密度(BMD)和骨矿含量(BMC)。

1.5.4胫骨骨折形态 分离胫骨组织，剔除表面多余组织后进行固定和脱钙，自来水冲洗,乙醇脱水，二甲苯固定,石蜡包埋,切片,二甲苯脱蜡,乙醇水化,HE染色,盐酸乙醇溶液中分化,自来水冲洗返蓝,伊红染色，中性树胶进行封片，显微镜下观察胫骨骨折形态变化。

1.5.5Western blot法检测胫骨组织OPN和局部黏着斑激酶(FAK)蛋白表达 取大鼠100 mg右侧胫骨的组织，裂解后提取总的核蛋白，并测量核蛋白浓度，分装后低温保存。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液按照4 ∶1的比例进行混匀，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳。在电泳板内注入50 μl的蛋白混合液进行电泳处理，然后将处理后的蛋白混合液转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，在组织中加入脱脂奶粉后封闭1 h。把一抗OPN(1 ∶500)和FAK(1 ∶500)加入其中，用磷酸盐缓冲液(PBS)进行漂洗，每次漂洗10 min，共漂洗3次，最后加入二抗稀释溶液，室温下再次封闭1 h。把PVDF膜取出后，再次用TBST(Tris-HCl+NaCl+吐温20)缓冲液进行漂洗，每次漂洗10 min，共漂洗3次，经显色等步骤用成像系统对印迹条带的光密度进行分析。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。

图1 两组大鼠右侧胫骨骨折处术后不同时间的X线检查结果

2 结果

2.1 两组骨痂大小、骨折愈合情况比较见图1。① 术后1周：A组骨折线仍清晰可见，未见明显骨痂生长；B组骨折线模糊，可见骨痂形成。② 术后3周：A组可见断端骨痂形成，骨痂未完全连接骨折两端，骨痂较B组明显小；B组骨折线模糊，骨折断端大量骨痂，骨痂连接骨折两端。③ 术后5周：A组仍可见模糊骨折线，骨痂连接骨折两端，骨痂重塑未完成；B组胫骨骨折基本完成重塑，骨折线消失，骨折愈合。两组结果比较显示，B组大鼠骨折愈合更快，更早地完成了骨痂重塑，且愈合过程中形成的骨痂更大。

2.2 两组生物力学检测结果比较见表1。最大载荷、弹性载荷、最大挠度：术后1、3、5周B组均明显大于A组(P<0.05)；A组术后各时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05)；B组随时间推移逐步升高(P<0.05)。

表1 两组大鼠生物力学检测结果比较

2.3 两组胫骨骨强度比较见表2。① BMD：术后1、3、5周B组均明显大于A组(P<0.05)；A组术后各时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05)；B组随时间推移逐步升高(P<0.05)。② BMC：术后1、3、5周B组均明显少于A组(P<0.05)；A组术后各时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05)；B组随时间推移逐步降低(P<0.05)。

表2 两组大鼠胫骨骨强度比较

2.4 两组胫骨骨折形态比较见图2。① 第1周：A组骨折区有大量成纤维细胞，无新生骨小梁；B组开始出现骨小梁，可见造血细胞灶。② 第3周：A组骨基质形成；B组可见骨性骨痂形成，有骨板形成，排列紊乱。③ 第5周：A组有板层样骨形成，排列较紊乱；B组可见骨基质中有大量骨细胞沉积。两组比较结果表明，B组骨痂组织中软骨组织形成更早，面积更大，软骨组织向骨组织转化的过程更快。

图2 两组大鼠右侧胫骨骨折处组织HE染色结果比较(×200)

2.5 两组OPN及FAK蛋白表达比较见表3。OPN、FAK蛋白表达：术后1、3、5周B组均明显大于A组(P<0.05)；A组术后各时间点比较差异均无统计学意义(P>0.05)；B组随时间推移逐步升高(P<0.05)。

3 讨论

3.1 NGF的作用骨生物力学是骨强度、骨结构、骨量的综合体现，其性能降低是骨折发生的重要原因之一[8-10]。对骨组织在外力作用下的力学特性和骨在受力后的生物学效应进行的骨生物力学研究，是对骨质量进行评定的一种可靠方法，可以评定骨脆性和预测骨折危险性[11-12]。研究[13-14]证实，NGF对骨的生成具有促进作用，可与成骨细胞结合，使骨愈合能力增强。而且，NGF可以抑制骨吸收，通过抑制破骨细胞分泌酸性和基质金属蛋白酶减少骨钙吸收和骨胶原的降解作用，保持骨的机械性能和生物功能。本研究中，B组最大载荷、弹性载荷、最大挠度在术后不同时间段均高于A组，这提示胫骨骨折经过NGF干预后，胫骨承受外力的能力和抵抗骨折的能力都得到提高。有研究[15]在治疗大鼠肋骨骨折时发现，经过NGF干预后，骨痂生成增多，骨痂的刚度和抗折弯强度增加，促进了骨折的愈合。BMD是骨质量的重要衡量指标，骨质量具有较强的促进骨折愈合的作用，在骨折的早、中、晚期均可以有效缩短骨折愈合时间，提高愈合质量。NGF能够促进骨折愈合，促进骨痂中胶原的吸收[16]。初步的临床研究[17]也证明，NGF可加快骨折患者的愈合过程。本研究中，与A组相比，B组在骨折后各时间段BMD升高，BMC下降，提示在经过NGF的干预后，调控了BDM、BMC水平，提高了骨质量，促进了骨折愈合。此外，X线片结果与HE染色结果均显示，B组大鼠骨折愈合更快，更早地完成了骨痂重塑，且愈合过程中形成的骨痂更大，这也证实了NGF可加快骨折愈合。

表3 两组大鼠OPN及FAK蛋白表达比较

3.2 OPN的作用生理状态下，骨形成和骨吸收处于平衡状态，当失去平衡时，就有可能出现骨代谢相关的疾病。OPN是一种广泛存在于人体组织中的多功能磷酸化蛋白，是分泌型磷酸化糖蛋白的一种，广泛分布在细胞间质，参与体内的多个代谢过程，能调节多种细胞因子的分泌和表达，参与细胞的增殖和分化，在组织细胞中的分布具有特异性，且在骨代谢中有着重要作用[18-19]。OPN能够对毛细血管的生长产生促进作用，使成骨细胞从活跃生长状态向成熟状态转化。杨渝勇 等[20]研究发现，OPN是皮质骨骨折的重要影响因子，骨中OPN水平的降低可增加髋部脆性骨折的发生。本研究中，B组术后不同时间段OPN、FAK蛋白表达均大于A组，这提示NGF可能是通过调控OPN、FAK水平作用于骨形成细胞，促进软骨及成骨细胞增殖、分化从而促进骨愈合。

综上所述，NGF可以提高胫骨的最大载荷、弹性载荷、最大挠度，提高抵抗骨折的能力，减少骨折的发生，同时还可提高OPN的表达水平，为骨折治疗的临床研究提供了新思路。本研究不足：仅从骨生物力学和骨强度方面观察NGF对骨愈合的影响，对骨折6周后的情况及不同剂量对骨折愈合的影响也未做进一步观察；NGF对骨痂组织的成分和结构等方面的影响及其影响机制还有待进一步的研究。