活血消瘿方调控Fas系统对结节性甲状腺肿大鼠模型甲状腺细胞凋亡的影响*

裴 迅，赵勇，李扬，房璁璁，付畅

（湖北省中医院/湖北省陈氏瘿病学术流派传承工作室，湖北 武汉 430074）

结节性甲状腺肿是一种常见的甲状腺疾病，多数患者无自觉症状，只有少数患者会出现颈前不适、肿块压迫感、呼吸和吞咽困难等症状[1]。中医学并没有结节性甲状腺肿的病名，主要根据其临床表现将其归类为“瘿瘤”“肉瘿”等范畴[2]。目前，结节性甲状腺肿的发病率正在逐年增加，对于其相关实验和临床研究也日益得到关注。临床研究证实，使用西医治疗结节性甲状腺肿的手段有限，且具有副作用和并发症[3]。因此，有必要探究疗效显著且副作用小的新疗法。近年来，中药治疗结节性甲状腺肿因具有稳定、副作用小等优点，逐渐得到广泛的关注[4]。活血消瘿方治疗结节性甲状腺肿具有较为肯定的疗效，且具有很好的安全性[5]，但具体药物作用机制尚不明确。本研究拟通过构建结节性甲状腺肿大鼠模型以探究活血消瘿方是否通过Fas系统参与调控甲状腺细胞凋亡，以此阐明活血消瘿方治疗结节性甲状腺肿的机制，从而为中药治疗结节性甲状腺肿提供新的思路和途径。

1 材料与方法

1.1 实验动物 5周龄健康SPF级SD雄性大鼠60只，体质量（150±10）g，由湖北省实验动物研究中心提供。动物生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。所有大鼠均在本院动物实验中心于恒温（20 ℃）、恒湿（50%）、12 h昼夜循环的SPF级实验室饲养，自由进食、进水。本研究已得到湖北省中医院伦理委员会批准，所有实验操作均符合动物伦理委员会要求，批号：20190312。

1.2 药物与试剂 活血消瘿方由蜣螂虫、土鳖虫、蜈蚣、桃仁、莪术、猫爪草、王不留行、柴胡等组成。上述药材均由本院药剂科提供，取同一批次压片成型前药粉，使用生理盐水分别配制成质量浓度为50、100和200 g/L的活血消瘿方溶液。丙基硫氧嘧啶（propylthiouracil，PTU）（批号：P3700000）、左甲状腺素钠片（商品名：优甲乐）（批号：PHR2880）、水合氯醛（批号：47335-U）均购自美国默克公司；苏木素-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色试剂盒（批号：G1120-100）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：PC0020）均购自北京Solarbio公司；TUNEL试剂盒（批号：QIA33）购自美国Sigma-Aldrich公司；促甲状腺激素（thyrotropin，TSH）ELISA试剂盒（批号：IB-E14160）、游离三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）ELISA试剂盒（批号：IB-E1490）、游离甲状腺素（free thyroxine，FT4）ELISA试剂盒（批号：IB-E12117）均购自江西艾博因公司；一抗：Fas配体（Fas Ligand，FasL，31 kDa）（批号：ab186671）、Fas（38 kDa）（批号：ab110021）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8（Caspase-8，55 kDa）（批号：ab25901）、Caspase-3（32 kDa）（批号：ab32351）和GAPDH（36 kDa）（批号：ab8245）均购自英国abcam公司；高敏型ECL化学发光检测试剂盒（批号：E412-01）、细胞/组织总RNA提取试剂（Trizol法）（批号：R401-01）均购自南京Vazyme公司；通用反转录试剂盒（批号：YT9036）购自北京YITA公司；BlazeTaqTMOne-StepGreen RT-qPCR试剂盒（批号：QP071）购自美国Gene Copoeia公司。

1.3 主要仪器 Voluson E8型彩色多普勒超声诊断系统（美国GE公司）；RM2235型病理切片机（美国Leica公司）；BX51型光学显微镜（日本Olympus公司）；1600型全自动数码凝胶图像分析系统系统（上海Tanon公司）；9600 Plus型荧光定量PCR系统（江苏LineGene公司）。

1.4 造模与分组 所有大鼠适应性饲养2周后，按照随机数字表法分为空白对照组、模型组、阳性对照组、活血消瘿方低剂量组、活血消瘿方中剂量组、活血消瘿方高剂量组，每组10只。空白对照组大鼠按照1 mL/100 g体质量灌胃生理盐水，其余各组大鼠均按照1 mL/100 g体质量灌胃0.1%PTU溶液[6]（生理盐水配制）造模。每天09:00:00灌胃1次，连续灌胃8周。所有大鼠于造模结束后通过彩色多普勒超声发现甲状腺两侧不规则变化，表面粗糙，呈现多个大小不一的结节，且结节回声强度不同，即可判断造模成功。

1.5 实验给药 自第9周起，每组按照1 mL/100 g体质量灌胃不同药物。阳性对照组大鼠灌胃给予0.1 mg/L的优甲乐[7]；模型组大鼠灌胃给予双蒸水；活血消瘿方低、中、高剂量组分别灌胃给予50、100、200 g/L的活血消瘿方溶液。取大鼠与人的等效剂量折算系数k=0.18，双蒸水配制，分别相当于成人临床用药剂量的1倍、2倍、4倍。每天09:00:00灌胃1次，连续灌胃4周[6]。空白对照组大鼠正常饲养，不予任何处理。

1.6 观察指标

1.6.1 留取血液、组织标本 灌胃4周后，大鼠禁食12 h，禁水2 h。给予10%水合氯醛腹腔麻醉成功后，使用剪刀在大鼠甲状软骨上方剪断，提起大鼠，将血液收集至5 mL促凝管中，采血量为2 mL。随后，将大鼠固定在鼠台上切开皮肤，暴露气管，找到甲状腺组织，完整分离后去除周围其他组织，称量组织质量。每只大鼠取左侧甲状腺一部分，浸泡于4%多聚甲醛缓冲液中用于制作组织切片；同时，取大鼠右侧甲状腺一部分保存于标记好的2 mL冻存管中，置于-20 ℃冰箱中，用于后期RT-PCR和Western blotting检测。

1.6.2 制备血清和组织切片 将收集到的血液静置2 h后，低温离心10 min分离血清，各收集0.5 mL血清于1.5 mL EP管中，于-20 ℃冰箱保存备用；将浸泡于多聚甲醛缓冲液中固定24 h后的甲状腺组织取出，在通风橱中修复平整，经脱水、包埋等一系列流程制备组织切片，用于进行苏木素-伊红（HE）染色、TUNEL染色和免疫组织化学研究。

1.6.3 血清TSH、FT3和FT4含量 严格按照ELISA试剂盒说明书检测血清TSH、FT3和FT4含量。

1.6.4 大鼠甲状腺病理学变化 将组织切片脱蜡后依次使用苏木素染色5 min、伊红染色3 min，脱水，封片，通过显微镜镜检，采集图像分析。

1.6.5 大鼠甲状腺细胞凋亡情况 将组织切片脱蜡后依次按照TUNEL试剂盒方法操作进行TUNEL染色。显微镜拍照后使用Image-Pro Plus 6.0软件对图片进行分析。凋亡细胞呈棕褐色，细胞核固缩，呈圆形、新月形或不规则形。凋亡指数=单个视野下凋亡细胞数量/单个视野下细胞总数×100%。

1.6.6 免疫组织化学法检测FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3表达 将制备好的组织切片脱蜡后置于EDTA缓冲液中进行抗原修复，添加5%牛血清白蛋白封闭30 min，后添加一抗FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3在4 ℃下覆盖组织孵育过夜。添加二抗4 ℃孵育50 min，添加DAB溶液显色。显色完全后使用苏木素复染后脱水干燥，使用中性树胶封固。显微镜拍照后使用Image-Pro Plus 6.0软件计算平均光密度（optical density，OD）值。

1.6.7 Western blotting法检测FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3蛋白表达水平 使用蛋白质裂解缓冲液裂解甲状腺组织提取总蛋白；BCA法对蛋白质进行定量分析。取蛋白质电泳后转膜、封闭，添加一抗FasL、Fas、Caspase-8、Caspase-3、GAPDH在4 ℃孵育过夜。添加二抗室温孵育2 h，使用ECL显影后经凝胶成像系统拍照记录。使用Image-Pro Plus 6.0软件分析各个蛋白条带的灰度值。

1.6.8 RT-PCR法检测FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA表达水平 使用Trizol法提取各组甲状腺组织RNA。经反转录制备cDNA，以cDNA为模板通过BlazeTaqTMOne-StepGreen RT-qPCR试剂盒和荧光定量PCR仪进行RT-PCR检测。使用2-ΔΔct法计算目的基因的相对表达水平。引物序列见表1。

1.7 统计学方法 使用SPSS 22.0统计软件进行分析，计量资料以“均数±标准差”表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清甲状腺功能指标含量及甲状腺组织质量比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清中TSH含量明显升高（P＜0.05），FT3、FT4含量及甲状腺组织质量均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和活血消瘿方低、中、高剂量组大鼠血清中TSH含量均明显降低（P＜0.05），FT3、FT4含量及甲状腺组织质量均明显升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，活血消瘿方低、中剂量组大鼠血清中TSH含量均明显升高，FT3、FT4含量及甲状腺组织质量均明显降低（P＜0.05）；活血消瘿方高剂量组大鼠血清中TSH、FT3、FT4含量及甲状腺组织质量与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠血清甲状腺功能指标含量及甲状腺组织质量比较（）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05；与活血消瘿方低剂量组比较，dP＜0.05；与活血消瘿方中剂量组比较，eP＜0.05

2.2 各组大鼠甲状腺组织结构变化 空白对照组大鼠甲状腺组织的滤泡排列规则整齐，大小均一，多呈球形或卵圆形，间质无炎症细胞浸润；模型组大鼠甲状腺组织的滤泡萎缩，上皮细胞高度肿胀，间质存在大量炎症细胞浸润；阳性对照组大鼠滤泡排列整齐，且呈现球形或卵圆形，上皮细胞肿胀和间质间炎症细胞浸润情况明显改善；活血消瘿方低剂量组大鼠甲状腺组织滤泡萎缩减少，大小不一，上皮细胞肿胀减弱，且存在较多的炎症细胞浸润；活血消瘿方中剂量组大鼠甲状腺组织滤泡萎缩情况得到一定的改善，上皮细胞肿胀和炎症细胞浸润也有一定减少；活血消瘿方高剂量组大鼠甲状腺组织滤泡萎缩情况基本改善，且排列较为整齐，上皮细胞肿胀和炎症细胞浸润明显改善。（见图1）

2.3 各组大鼠甲状腺细胞凋亡情况 凋亡细胞呈棕褐色，细胞核固缩，呈圆形、新月形或不规则形。与空白对照组比较，模型组大鼠甲状腺细胞凋亡指数明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和活血消瘿方低、中、高剂量组大鼠甲状腺细胞凋亡指数均明显升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，活血消瘿方低、中剂量组大鼠甲状腺细胞凋亡指数明显降低（P＜0.05）；活血消瘿方高剂量组大鼠甲状腺细胞凋亡指数与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图2、表3）

表3 各组大鼠甲状腺细胞凋亡指数比较（）

表3 各组大鼠甲状腺细胞凋亡指数比较（）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05；与活血消瘿方低剂量组比较，dP＜0.05；与活血消瘿方中剂量组比较，eP＜0.05

2.4 各组大鼠甲状腺组织FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达（免疫组化）比较 与空白对照组比较，模型组大鼠甲状腺组织中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3的平均光密度值均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和活血消瘿方低、中、高剂量组大鼠甲状腺组织中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3的平均光密度值均明显升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，活血消瘿方低、中剂量组大鼠甲状腺组织中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3的平均光密度值均明显降低（P＜0.05）；活血消瘿方高剂量组大鼠甲状腺组织中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3的平均光密度值与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图3、表4）

表4 各组大鼠甲状腺组织FasL、Fas、Caspase-8 和Caspase-3 的平均光密度值比较（）

表4 各组大鼠甲状腺组织FasL、Fas、Caspase-8 和Caspase-3 的平均光密度值比较（）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05；与活血消瘿方低剂量组比较，dP＜0.05；与活血消瘿方中剂量组比较，eP＜0.05

2.5 各组大鼠甲状腺组织FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白表达（Western blotting）比较 与空白对照组比较，模型组大鼠甲状腺组织中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和活血消瘿方低、中、高剂量组大鼠甲状腺组织中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，活血消瘿方低、中剂量组大鼠甲状腺组织中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05）；活血消瘿方高剂量组大鼠甲状腺组织中FasL、Fas、Caspase-8和Caspase-3蛋白相对表达量与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见图4、表5）

表5 各组大鼠甲状腺组织FasL、Fas、Caspase-8 和Caspase-3 蛋白相对表达量比较（）

表5 各组大鼠甲状腺组织FasL、Fas、Caspase-8 和Caspase-3 蛋白相对表达量比较（）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05；与活血消瘿方低剂量组比较，dP＜0.05；与活血消瘿方中剂量组比较，eP＜0.05

2.6 各组大鼠甲状腺组织FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相对表达量比较 与空白对照组比较，模型组大鼠甲状腺组织中FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相对表达量均明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和活血消瘿方低、中、高剂量组大鼠甲状腺组织中FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相对表达量均明显升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，活血消瘿方低、中剂量组大鼠甲状腺组织中FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相对表达量明显降低（P＜0.05）；活血消瘿方高剂量组大鼠甲状腺组织中FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相对表达量与阳性对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。（见表6）

表6 各组大鼠甲状腺组织FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA 相对表达量比较（）

表6 各组大鼠甲状腺组织FasL mRNA、Fas mRNA、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA 相对表达量比较（）

注：与空白对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性对照组比较，cP＜0.05；与活血消瘿方低剂量组比较，dP＜0.05；与活血消瘿方中剂量组比较，eP＜0.05

3 讨 论

结节性甲状腺肿是临床上常见的结节性甲状腺疾病之一，多数结节性甲状腺肿患者无明显临床表现，常因合并颈部肿大、甲状腺功能异常或产生压迫感被发现[8]。随着近年来超声检查的普及，多数患者可通过体检被发现[9]。虽然结节性甲状腺多为良性结节，但患者一方面因担心结节继续增大需接受手术治疗，另一方面则因担心其恶变，严重困扰患者的生活。因此，控制结节的增大及阻止其恶化是当前治疗的关键。若能明确结节性甲状腺肿的具体发生分子机制，不仅可以为早期诊断提供支持，而且可以为研制针对性的干预措施提供帮助。

活血消瘿方是我院陈如泉治疗结节性甲状腺肿的经验方，具有活血化痰、消瘿散结的功效[10]。吴淑琼等[11-12]研究发现，活血消瘿方治疗结节性甲状腺肿的显著效果，且不良反应较少。然而，活血消瘿方是一种由多成分组成的中药复方制剂，在体内具有复杂的代谢过程，其对药物引起的动物结节性甲状腺肿的作用机制尚不清楚。因此，选择同等条件下的动物模型研究更具有可信度。目前常用的甲状腺肿造模方法很多，其中抗甲状腺药物诱导的甲状腺肿是一种较为稳定、可靠的方法[13]。此外，鼠类是常用的造模动物，因小鼠甲状腺体积过小，为得到足够的标本量，本研究选择用大鼠作为研究对象，同时由于雌激素对甲状腺细胞的功能具有一定的影响，故本实验选择雄性大鼠造模。本研究使用抗甲状腺药物PTU诱导结节性甲状腺肿的方法造模。结果显示，结节性甲状腺肿大鼠血清中TSH含量明显升高，FT3、FT4含量及甲状腺组织质量明显降低，而活血消瘿方可降低结节性甲状腺肿大鼠血清中TSH含量，升高FT3、FT4含量及增加甲状腺组织质量，且呈剂量依赖性。研究证实，TSH、FT3、FT4是甲状腺的主要功能指标，其水平变化对于甲状腺疾病诊断具有重要意义[14]。结合本研究结果，推测活血消瘿方可明显改善甲状腺功能。同时，本研究通过对甲状腺组织结构分析发现，活血消瘿方可明显减轻结节性甲状腺肿大鼠的甲状腺组织结构改变，表明活血消瘿方可有效改善甲状腺结构及功能，且疗效随着剂量的升高而呈现一定的上升趋势。

细胞凋亡是一个自然发生的程序性细胞死亡过程，在成年组织的发展和稳态中具有重要作用，细胞凋亡可以清除无用、多余、有害的细胞，而异常的细胞凋亡则会导致一系列疾病的发生[15]。目前研究表明，活血消瘿方治疗甲状腺肿主要是通过促进甲状腺细胞凋亡或控制甲状腺细胞增殖实现的[16]。活血消瘿方可通过调控结节性甲状腺肿患者血清相关生长因子的水平抑制甲状腺滤泡细胞增生[11]，且可通过调控凋亡相关分子可溶性Fas、FasL诱导甲状腺细胞凋亡，缩小甲状腺结节直径，从而达到治疗效果[12]。本研究发现，活血消瘿方不仅可以提高结节性甲状腺肿大鼠甲状腺细胞凋亡指数，而且可有效促进Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3蛋白和mRNA表达水平。Fas属于肿瘤坏死因子和神经生长受体超家族，在调控细胞凋亡中发挥了重要作用。Fas与其天然配体FasL共同构成Fas系统[17]。其中，Fas是一种位于细胞表面的Ⅰ型跨膜蛋白，可通过与FasL结合形成一种蛋白复合体进而激活凋亡起始者Caspase-8引发Caspase蛋白酶级联反应，最终激活Caspase-3诱发细胞凋亡[18]。本研究结果表明，活血消瘿方可通过激活Fas系统诱发Caspase-8、Caspase-3活化，进而促进结节性甲状腺肿大鼠甲状腺细胞凋亡。

本研究通过活血消瘿方干预PTU诱导的结节性甲状腺肿大鼠，从Fas系统调控甲状腺细胞凋亡角度探究该方的作用机制，为结节性甲状腺肿的中医治疗提供了实验依据。然而，本研究尚存在一定的局限性。首先，由于知识的局限性和片面性，可能对部分理论和知识的理解不够深刻，所得的结论存在一定的偏差；其次，细胞凋亡的调控机制极其复杂，多个通路可以发生交互作用，共同形成复杂的调控网络。虽然研究证实活血消瘿方参与调控Fas系统，但也可能仅是一个初步的发现。鉴于以上不足，以后的研究还须不断完善、修正活血消瘿方的治疗机制，得出更令人信服的结论。