利用E.coli表达PCV2 Cap蛋白病毒样颗粒的不同策略及免疫原性评价

赵 强，刘 莹，赵云环，翟 刚，张 帅，郭晓旭，范京惠，左玉柱*

(1.河北农业大学动物医学院，河北 保定 071001；2.河北省兽医生物技术创新中心，河北 保定 071001)

猪圆环病毒2型(PCV2)是圆环病毒科(Circoviridae)的一员，是已知的最小的DNA病毒之一，该病毒粒子呈20面体对称，无包膜，直径为17～20 nm，含有环状单链DNA[1]。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、皮炎与肾病综合征(PDNS)的主要致病因素，现统称为猪圆环病毒病(PCVAD)，该病可导致患病猪生长缓慢、呼吸窘迫、繁殖障碍和免疫机能下降，进而导致猪只死亡率升高，饲料报酬低，繁殖能力减弱[2-3]。PCVAD呈世界性流行，给全球养猪业造成了巨大的经济损失[4]。因此，探索出一种易于制备、效果良好且价格低廉的VLPs疫苗是有必要的。

PCV2 ORF2编码的衣壳蛋白是病毒的唯一结构蛋白，决定病毒的抗原性，在体外可自发的组装成病毒样颗粒(VLPs)，市场上已被用作亚单位疫苗的主要成份，然而现有的PCV2 VLPs疫苗主要在重组杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统中生产，但在该系统中生产重组蛋白需要昂贵的仪器设备和苛刻的试验环境，增加了疫苗成本[5-7]。但由于ORF2序列的N端核定位信号区(NLS)含有大量大肠杆菌稀有密码子，这使得在大肠杆菌中表达Cap蛋白是困难的[8]。虽然在Cap蛋白N端截短3～27个氨基酸仍可形成VLPs，但是其稳定性远不如天然的Cap蛋白所形成的VLPs[9]。因此。本研究选择了含真核细胞稀有密码子tRNA的表达菌株Rosetta-gamiB，同时也将Cap全基因进行密码子优化，或将两者相结合，旨在比较表达的Cap蛋白产量、镍亲和层析纯化效率、VLP组装程度及免疫原性，以期探究出一种最佳的表达策略。

1 材料与方法

1.1 实验动物6～8周龄SPF BALB/c小鼠购自北京斯贝福公司。

1.2 主要试剂小鼠抗PCV2 IgG抗体定性检测试剂盒(ELISA)购自江苏博深生物科技有限公司。小鼠TNF-α ELISA试剂盒、小鼠IL-4 ELISA试剂盒和小鼠γ干扰素ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)购自北京康为世纪。辣根过氧化物酶(HRP)标记的6×His Tag小鼠单克隆抗体、HRP标记兔抗猪IgG抗体购自 Proteintech Beijing公司;Rosetta-gamiB感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司；猪源PCV2 Cap多克隆抗体、E.coliDH5α、BL21感受态细胞由本实验室冻存。

1.3 重组质粒的构建根据PCV2(GenBank：KX641138.1)ORF2序列，设计扩增引物PCV2-nCap-F：5′-CGGGGTACCACGTATCCAAGGAGGCGT-3′和PCV2-nCap-R：5′-CCCAAGCTTGG-GTTTAAGTGGGGGGTC-3′(下划线代表酶切位点)，从临床发病猪中扩增出PCV2 ORF2序列，利用密码子适配工具对ORF2的序列进行密码子优化(http://www.friendbio.com/codon.html)，由上海生物工程有限公司合成，优化后的序列CAI=1，且所编码的蛋白序列不变(图1)。随后设计密码子优化后的Cap扩增引物PCV2-yCap-F：5′-CGCGGATCCATGACCTACCCGCGTCGTCG-3′和PC-V2-yCap-R：5′-CCCAAGCTTTTACGGTTTCAG-CGGCGGGT-3′(下划线代表酶切位点)。未经密码子优化的ORF2序列，经KpnⅠ和HindⅢ双酶切，经密码子优化的ORF2 序列，经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，分别克隆至pET-32a表达载体上，构建重组质粒pET-32a-nCap和pET-32a-yCap。将上述重组质粒分别转入大肠杆菌感受态细胞BL21和Rosetta-gamiB中，挑取阳性单克隆菌落振荡培养14 h，提取质粒进行双酶切鉴定，并将鉴定正确的送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序正确后并分别命名为 pET-32a-nCap(BL21)、pET-32a-nCap(Rosetta)、pET-32a-yCap(BL21)、pET-32a-yCap(Rosetta)。

1.4 PCV2 Cap蛋白的表达与鉴定将鉴定正确的重组菌在含氨苄青霉素(100 mg/L)的5 mL LB液体培养基中，37℃、200 r/min培养14 h后，各取1 mL 接种于100 mL含氨苄青霉素的液体LB培养基中培养至D600为0.6左右，加入IPTG诱导4 h，收集菌体并称质量，将菌体沉淀重悬在菌体裂解液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，5%甘油，0.05% Tween-80，10 mmol/L β-巯基还原剂，pH=8.0)中，超声破碎后，10 000×g离心3 min，收集上清与沉淀进行SDS-PAGE鉴定。

1.5 PCV2 Cap蛋白的纯化各取15 mL超声后的上清液经镍亲和层析法进行纯化，各个镍色谱柱体积为3 mL。纯化流程参考His-Tag蛋白纯化试剂盒：以平衡液15 mL(50 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，5%甘油，0.05% Tween-80，pH=8.0)平衡Ni-NTA亲和层析柱；将上清液与菌体裂解液等体积混匀后，以0.3 mL/min 的流速，通过重力作用与Ni-NTA亲和层析柱结合；以180 mL的洗涤液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，5%甘油，0.05% Tween-80，pH=8.0)洗去杂蛋白；最后以洗脱液(20 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，5%甘油，0.05% Tween-80，pH=8.0)对目的蛋白进行洗脱。洗脱得到的蛋白进行SDS-PAGE分析鉴定。

1.6 Western blot检测将pET-32a-yCap(BL21)、pET-32a-nCap(Rosetta)、pET-32a-yCap(Rosetta)所表达的Cap蛋白分别命名为VLP-A,VLP-B，VLP-C。取1.5纯化后的蛋白样本，在12%的蛋白胶中分离后，按照说明书进行，使用半干转膜仪转印到硝酸纤维素膜(NC膜)上。在含5%脱脂奶粉的PBST中4℃封闭过夜。封闭结束后，各自用猪源PCV2多克隆抗体(1∶1 000)在室温下孵育2 h、HRP标记的6×His Tag小鼠单克隆抗体(1∶5 000)在室温下孵育1 h。孵育完毕，用PBST清洗NC膜5次，每次3 min，随后将使用HRP标记的6×His Tag小鼠单克隆抗体的样品进行显色，观察结果。使用PCV2多克隆抗体的样品，在含5%脱脂奶粉的PBST中孵育HRP标记兔抗猪IgG抗体(1∶5 000)1 h，PBST清洗5次，每次3 min，随后进行显色，观察结果。

1.7 可溶性Cap蛋白透射电镜观察取纯化后的蛋白悬液10 μL滴到铜网上(300目)，室温静置10 min 后，用滤纸的毛边吸去多余的液体，滴入10 μL 磷钨酸负染色液，室温静置2 min，用滤纸吸去染色液，自然干燥后用于透射电镜观察。

1.8 小鼠免疫试验将6～8周龄的24只小鼠随机分为4组(每组6只)。1～3组小鼠皮下多点注射200 μL(含50 μg抗原)与弗氏佐剂等体积混匀的VLP-A、VLP-B和VLP-C。第4组小鼠注射等量的弗氏佐剂。首次免疫后的小鼠在免疫后第2周用相同剂量的抗原与弗氏不完全佐剂等体积混合后加强免疫。分别于0，14，21，28，35，42 d采集血清进行PCV2 IgG特异性抗体与细胞因子检测，具体操作参照说明书。

2 结果

2.1 序列优化及重组质粒鉴定根据大肠杆菌密码子偏爱性，优化后的序列CAI=1(图1)。用设计的2对Cap基因特异性引物，经PCR扩增后，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，得到702 bp左右的目的片段，与预期结果相符，构建的重组质粒pET-32a-yCap和pET-32a-nCap分别经BamHⅠ、HindⅢ双酶切和KpnⅠ、HindⅢ双酶切，在702 bp左右可见明显的目的条带(图2)，经测序，结果完全相符。

1.重组质粒pET-32a-yCap经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定；2.PCR阴性对照；3.密码子优化后的PCV2 Cap基因；4.重组质粒pET-32a-nCap经KpnⅠ和HindⅢ双酶切鉴定；5.PCR阴性对照；6.天然的PCV2 Cap基因；M.DL5000 DNA Marker

2.2 重组菌的产量、诱导表达及可溶性分析将IPTG诱导后的重组菌体与诱导前作对比，SDS-PAGE分析后如图3所示，诱导后的重组菌pET-32a-nCap(BL21)不表达或表达量极低，pET-32a-yCap(BL21)、pET-32a-nCap(Rosetta)和pET-32a-yCap(Rosetta)成功表达，蛋白大小为47 kDa，与理论值相符(图4)，诱导表达后的菌体沉淀分别为2.59，0.82，1.46 g，重悬沉淀后超声裂解，分别对上清和沉淀进行分析，结果显示，绝大部分蛋白以可溶性方式存在，只有少许蛋白存在于包涵体中(图5)。

M.Blue Plus Protein Marker;1.诱导后pET-32a/BL21蛋白；2.诱导前pET-32a-nCapBL21蛋白；3.诱导后pET-32a-nCapBL21蛋白；4.诱导前pET-32a-yCapBL21蛋白；5.诱导后pET-32a-yCapBL21蛋白；6.诱导后pET-32a/Rosetta蛋白；7.诱导前pET-32a-nCapRosetta蛋白；8.诱导后pET-32a-nCapRosetta蛋白；9.诱导前pET-32a-yCapRosetta蛋白；10.诱导后pET-32a-yCapRosetta蛋白

图4 pET-32a-Cap重组质粒结构图谱

M.Blue Plus Protein Marker;1.诱导后pET-32a-yCap(BL21)蛋白沉淀；2.诱导后pET-32a-yCap(BL21)蛋白上清；3.诱导后pET-32a-nCap(Rosetta)蛋白沉淀；4.诱导后pET-32a-nCap(Rosetta)蛋白上清；5.诱导后pET-32a-yCap(Rosetta)蛋白沉淀；6.诱导后pET-32a-yCap(Rosetta)蛋白上清

2.3 可溶性蛋白的纯化重组菌表达的可溶性蛋白经镍亲和层析纯化后，以收集的洗脱液每1 mL为1个单位，每单位各取40 μL与5×SDS上样缓冲液混匀，105℃变性10 min，取20 μL进行SDS-PAGE，如图6所示，得到了纯度较高的目的蛋白，但VLP-B和VLP-C的回收量低，纯化困难。

M.Blue Plus Protein Marker;1～6.纯化后前6个单位pET-32a-yCap(BL21)蛋白; 7～12.纯化后前6个单位pET-32a-nCap(Rosetta)蛋白;13～18.纯化后前6个单位pET-32a-yCap(Rosetta)蛋白

2.4 可溶性蛋白的Western blot分析将纯化后的蛋白进行Western blot鉴定，结果显示，在47 kDa处有1条明显的特异性条带，符合预期，说明所表达的Cap蛋白含有His-Tag且能够与猪源PCV2多克隆抗体发生特异性反应,具有良好的反应原性(图7)。

A.HRP标记的兔抗猪IgG抗体;B.HRP标记的6×His Tag小鼠单克隆抗体；M.Blue Plus Protein Marker;1.纯化后pET-32a-yCap(BL21)蛋白; 2.诱导后pET-32a/BL21；3.纯化后pET-32a-nCap(Rosetta)蛋白；4,6.诱导后pET-32a/Rosetta；5.纯化后pET-32a-yCap(Rosetta)蛋白

2.5 可溶性蛋白病毒样颗粒的透射电镜观察取10 μL 经过磷钨酸负染色后的蛋白悬液，在透射电镜下放大200 000倍，可观察到大小均一、形态规则，直径为20 nm左右的病毒样颗粒，与天然的猪圆环病毒粒子极为相似。结果显示，本研究制备的3种Cap蛋白能够自发的组装成VLPs且形态结构良好(图8)。

A.VLP-A；B.VLP-B;C.VLP-C

2.6 ELISA检测抗体与细胞因子水平为评估不同的VLPs在小鼠体内的免疫原性，每只小鼠接种50 μg抗原。定期采集血清用于检测鼠抗猪PCV2 IgG特异性抗体及IL-4、TNF-α和IFN-γ。如图9A所示，所有疫苗组在接种后14 d即可检测到小鼠血清中抗PCV2 IgG抗体，阳性率为100%，到 42 d 仍保持较高水平。在28 d，抗体水平：VLP-C>VLP-B>VLP-A>Inactivated Strain ZJ/C。细胞因子检测结果可知，与对照组相比，所有疫苗接种组检测到显著性差异(P<0.01)量的IL-4(图9B)、TNF-α(图9C)和IFN-γ(图9D)。组间比较结果显示，VLP-C所刺激的细胞因子反应最强烈且与VLP-A具有显著性差异，与VLP-B无显著性差异，表明VLP-C的组装程度要优于VLP-B和VLP-A。

图9 免疫小鼠后PCV2 IgG抗体及细胞因子水平的测定

3 讨论

现有市场上暂无针对PCV2的特效药，接种疫苗是控制PCV2感染的一种有效而经济的方法。目前，国内市场上多为灭活疫苗和亚单位疫苗，灭活疫苗通常在PK-15细胞中生产，但其产量低，灭活后需要多次免疫才能达到理想的效果。PCV2病毒样颗粒是一种免疫效果极佳的亚单位疫苗，因其具有天然的PCV2病毒形态，可刺激机体产生高水平的应答反应。昆虫细胞-杆状病毒真核表达系统是生产PCV2 VLPs应用最为广泛的平台，但是其成本和产量限制了兽用疫苗的应用和生产。

有学者为了降低成本开始探索在大肠杆菌中生产PCV2 VLPs，LI等[10]将PCV2b Cap蛋白与PCV2a、PCV2d、PCV2e的病毒中和表位串联，在大肠杆菌中表达为弹性蛋白样多肽(ELPylated)结合的Cap蛋白，形成了VLPs，具有良好的免疫原性，但纯化过程相对繁琐。WU等[11]将一个全长密码子优化的Cap蛋白在大肠杆菌中表达并基于尺寸排阻色谱的单柱、高通量分馏程序纯化，组装成25～30 nm的VLPs，提高了蛋白的产量。另有研究表明，天然的衣壳蛋白只能在拥有稀有密码子的tRNA菌株中才能表达，但未表明能否形成VLPs[12]。Cap蛋白N端的核定位信号区是阻碍其在原核表达系统中表达的一个主要原因，但NLS区对于VLPs的组装和稳定具有重要意义，N端截断至27个氨基酸虽能形成VLPs，但其稳定性大大降低[13]。

因此，本试验除了将Cap蛋白进行密码子优化，还尝试将未经密码优化的nCap转入拥有稀有密码子的tRNA菌株Rosetta-gamiB中，观察能否形成VLPs。形成VLP-B后，又提出将Cap全长密码子优化后并转入Rosetta-gamiB中，能否进一步提高产量和促进VLPs的组装的设想。此外，由于VLPs的自组装，导致N端的His标签被折叠蛋白的内部，无法暴露在外，常规的亲和层析法无法直接将VLPs纯化[14]。为了节约成本，简化步骤，本研究通过调整组装液的成份并加入β-巯基还原剂和甘油等使His标签重新暴露出来，再通过透析方式除去还原剂重组装VLPs，成功得到了大小约为20 nm形态规则的VLPs，简化了纯化的程序。为进一步评价不同策略，在相同体系中比较了各自的产量、镍亲和层析效率和免疫效果，结果显示，VLP-C诱导产生的抗体水平和Th1型(TNF-α、IFN-γ)和Th2型(IL-4)细胞因子反应强于VLP-B和VLP-A，其中VLP-A最差，但均促进了Th1/Th2型细胞因子平衡反应，可间接证实VLP-C的组装程度强于VLP-B和VLP-A。但VLP-C的产量和纯化效率不如VLP-B和VLP-A，其中VLP-A的产量和纯化效果最好。结果表明，将天然的衣壳蛋白全长进行密码子优化并转入拥有真核表达系统中稀有密码子的tRNA菌株表达的VLP-C组装程度及免疫原性最好，两种策略结合的效果要强于单一的策略，密码子优化的方法不如提供稀有密码子的tRNA，组装程度越好的VLP越不易通过镍亲和层析法纯化，需要进一步探究纯化方法。综上所述，在含有稀有密码子tRNA的表达菌株中表达密码子优化的Cap蛋白，可获得免疫原性和组装程度最好的VLPs，但在实际生产实践中，应综合考虑产量、纯化成本及免疫效果，本试验为PCV2亚单位疫苗的制备及相关生物制品的生产提供了有价值的参考。