山羊痘病毒P32基因的截短表达及间接ELISA方法的建立和应用

孟卫芹，王金良*，许崇友，陈金龙，沈志强*

(1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.日照市东港区动物疫病预防控制中心，山东 日照 276800；3.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003)

山羊痘(goatpox，GTP)是由山羊痘病毒(goatpox virus，GTPV)感染山羊引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，感染后可引起病羊皮肤、消化道黏膜和呼吸道出现痘疹等症状，是最为严重的一种动物痘病[1-2]。该病呈地方流行特点[3]，主要发生于非洲北部和中部、中东地区和亚洲的部分国家，近几年在我国多省份均有羊痘发生的相关报道[4-5]。该病属于国家一类动物疫病，危害性很大，羊群的感染率和病死率均很高，感染羔羊的病死率可达100%[6]，对我国部分地区养羊业和当地经济造成巨大损失。

P32蛋白是位于GTPV膜表面的一种主要结构蛋白，是所有分离株中共有的且特异性很强的结构蛋白[7]，研究表明其体外表达产物可用于建立血清学诊断技术。本研究通过PCR技术扩增了GTPV P32蛋白优势抗原区(2-141AA)基因，并在大肠杆菌中获得了表达，以纯化的P32蛋白为包被抗原，建立GTPV抗体间接ELISA检测方法，并评估了该方法的特异性、敏感性和重复性，为山羊痘血清学检测、疫病诊断提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、表达载体pET-28a(+)、GTPV、羊副流感病毒(PIV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口蹄疫病毒(FMDV)山羊阳性血清、39份山羊痘抗体阴性血清均由本实验室保存；122份临床血清样品为内蒙古、山东两地羊养殖区送检保存；DNA Marker、低分子量蛋白Marker、DNA提取与DNA回收试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司；PCR扩增试剂、T4DNA Ligase、NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、DAB底物显色液均购自宝生物(大连)工程有限公司；兔抗羊HRP-IgG购自Sigma公司。

1.2 引物设计与合成参考GenBank公布的GTPV P32基因序列(登录号：MK948083.1)，采用DNAStar Protean功能对P32基因进行抗原决定簇的表位分析，筛选主要抗原域(2-141AA)，应用Primer 5.0软件设计1对引物，上游引物P32F：5′-GGGAATTCCATATGGCAGATATCCCATT-3′(NdeⅠ)；下游引物P32R：5′-CGCCGCTCGA-GTTCAATTATAATGTTATA-3′(XhoⅠ)，序列由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

1.3 PCR扩增与回收以提取的病毒基因组DNA为模板，PCR扩增体系：PCR Master Mix(2×)10 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，H2O 6 μL，终体积为20 μL。反应条件：95℃ 3 min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，共32个循环；72℃延伸10 min，4℃终止。将PCR产物用胶回收试剂盒回收，-20℃保存备用。

1.4 重组载体的构建与鉴定利用NdeⅠ/XhoⅠ双酶切PCR产物和pET-28a(+)质粒，将酶切回收后的基因片段克隆到pET-28a(+)质粒上，转化DH5α感受态细胞，经PCR及酶切鉴定后获得重组表达载体pET28a-P32，鉴定阳性的克隆送通用生物系统(安徽)有限公司测序。

1.5 重组蛋白的表达、纯化与Western blot鉴定将测序正确的pET28a-P32重组质粒转化E.coliBL21(DE3)感受态进行诱导表达及SDS-PAGE分析。使用镍离子亲和层析法纯化目的蛋白，纯化后的蛋白经SDS-PAGE后，转移至NC膜上，用5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，以1∶100稀释的GTPV阳性血清为一抗，以1∶2 000稀释的兔抗羊HRP-IgG为二抗进行Western blot鉴定。

1.6 ELISA方法的建立

1.6.1反应条件的优化 采用棋盘法，将抗原按照2倍倍比稀释(4，2，1，0.5，0.25 mg/L)，在酶标板上按100 μL/孔包被，GTPV阴、阳性血清自左至右2倍倍比稀释，稀释度依次为1∶25，1∶50，1∶100，1∶200。根据阳性血清D450 nm值(P)和阴性血清D450 nm值(N)的比值即P/N值筛选出最佳抗原包被浓度和血清稀释度。进一步利用棋盘法对兔抗羊HRP-IgG稀释度(1∶500，1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000)，底物显色时间(5，10，15，20 min)等条件进行优化，最终确定间接ELISA的最佳反应条件。

1.6.3特异性试验 选取PIV、PPRV、FMDV、GTPV山羊阳性血清及GTPV山羊阴性血清，用优化的间接ELISA方法进行检测，每份血清样本均做3个重复，以评价该方法的特异性。

1.6.4敏感性试验 选取GTPV抗体阴性、阳性血清各2份，按2倍倍比稀释(1∶25～1∶1 600)，利用建立的间接ELISA方法检测，根据阳性血清的D450 nm值判定阳性血清的最大稀释倍数，以评价该方法的敏感性。

1.6.5重复性试验 选取同一批次包被的酶标板检测6份GTPV山羊血清，每份做6个重复，计算其变异系数(CV)以评价所建立ELISA方法的批内重复性；选用3个不同批次包被的酶标板检测上述6份血清，每份做3个重复，计算其批间CV以评价该方法的批间重复性。

1.6.6临床样本的检测 利用本试验建立的间接ELISA方法和商品化ELISA试剂盒对122份临床山羊血清样品进行检测，比较两者的检测结果，计算2种方法检测结果的符合率，评估建立的ELISA方法的临床应用效果。

2 结果

2.1 PCR扩增及重组载体的构建PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，成功扩增了P32优势抗原区基因，基因片段大小约为420 bp(图1)，与理论值相符。构建的重组载体pET28a-P32经NdeⅠ/XhoⅠ双酶切(图2)及测序表明目的基因准确插入到指定位置。

M.DL2000 DNA Marker；1，2.P32基因PCR扩增产物；3.阴性对照

M1.DL2000 DNA Marker；M2.DL8000 DNA Marker；1.重组质粒的NdeⅠ/XhoⅠ双酶切产物；2.重组质粒的XhoⅠ单酶切产物

2.2 P32蛋白的表达及鉴定结果重组质粒序列鉴定正确后，转入表达菌BL21(DE3)感受态，经终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导后，SDS-PAGE显示在约16 kDa处可见目的条带(图3A)，与理论大小值一致；目的蛋白主要在沉淀中，使用镍离子亲和层析法成功纯化到P32蛋白，质量浓度为1.1 g/L；Western blot结果显示，重组蛋白可以与GTPV山羊阳性血清发生特异性反应(图3B)，具有良好的抗原反应性。

2.3 ELISA方法的建立

2.3.1反应条件的优化 根据P/N值确定抗原的包被浓度、血清、二抗的最佳稀释倍数及反应时间，优化后的反应条件见表1。

表1 间接ELISA方法反应条件的优化结果

2.3.3特异性试验 应用该方法对PIV、PPRV、FMDV阳性血清及GTPV阴、阳性对照进行检测，结果显示，只有GTPV山羊阳性血清检测结果为阳性，其余均为阴性(表2)，表明该方法具有良好的特异性。

表2 特异性试验结果

2.3.4敏感性试验 应用建立的方法对GTPV阴性、阳性山羊血清进行敏感性试验。结果显示，2份GTPV阳性血清稀释800倍后，D450 nm值仍大于临界值(图4)，说明建立的间接ELISA方法的敏感性较高。

图4 敏感性试验结果

2.3.5重复性试验 利用建立的方法对6份临床山羊血清进行批内、批间重复性试验。结果显示，批内、批间重复试验CV分别在4.14%～8.47%和1.61%～6.87%之间，均小于10%(表3)，说明该方法重复性较好。

表3 重复性试验结果(n=6)

2.3.6临床样品检测 采用本试验建立的间接ELISA方法与商品化试剂盒同时对122份临床山羊血清样品进行抗体水平检测。结果显示，经商品化试剂盒检测的107份阳性血清中检出5份阴性，15份阴性血清中检测出2份阳性，总体符合率为94.26%(表4)。表明该方法准确性较高。

表4 间接ELISA方法与商品化试剂盒对比符合率结果

3 讨论

GTPV在世界范围内均有分布，其传播速度快，发病率和死亡率均较高，给养羊业带来严重的损失，我国对该病的控制主要通过接种疫苗来完成，但不同地区羊群免疫的不确定性导致了本病时有发生[8]。目前我国GTP的血清学诊断方法主要有[9-10]琼脂扩散试验(AGP)和反向间接血凝试验(RIHA)、对流免疫电泳技术(CIE)、荧光抗体技术(FAT)、病毒中和试验(VNT)等，但这些方法存在周期长、敏感性和特异性不强、设备昂贵等缺点。ELISA方法具有敏感性高、特异性强、简单、快速和高通量等特点，可用于GTP的流行病学调查和抗体免疫监测。

探究GTPV中可用于ELISA抗体检测的靶蛋白一直是研究热点，张琪等[11]通过原核表达获得了大小约为35 ku的重组ORF103蛋白，建立的GTPV血清抗体的间接 ELISA方法，可用于GTPV抗体水平的检测；陈冬杰等[12]对GTPV的RPO30进行原核表达，将纯化的His-RPO30蛋白免疫BALB/c小鼠获得了针对GTPV RPO30蛋白的单克隆抗体，为RPO30蛋白功能的深入研究提供了物质基础；赵宏吉等[13]将GTPV G9蛋白作为包被抗原，建立的检测GTPV间接ELISA方法，证实与P32蛋白作为包被抗原建立的 ELISA方法的检测效果相似。GTPV的靶蛋白中对P32蛋白的研究最为深入，是目前世界各国公认的诊断和鉴定羊痘病毒的重要基因。P32蛋白是典型的膜蛋白[14-15]，在ELISA中反应性最好，但全长很难在体外表达，商品化的试剂盒较少。P32蛋白2-141AA区域含有重要的抗原决定簇，是该蛋白的优势抗原区，本研究将该区域在大肠杆菌中进行截短表达，经纯化获得了表达量较高的P32蛋白，Western blot鉴定结果表明该蛋白具有良好的特异性和反应原性，为快速检测方法的建立奠定了抗原基础；以纯化的P32蛋白作为包被抗原，经优化后建立的GTPV抗体间接ELISA检测方法与PIV、PPRV、FMDV的山羊阳性血清无交叉反应，特异性较强；抗体阳性血清稀释至800倍仍能检出，敏感性较好；与商品化试剂盒检测结果的总符合率达94.26%，表明该方法可以用于GTPV大规模临床样本的检测。

综上所述，本研究利用P32基因的截短表达建立的间接ELISA方法为GTPV疫苗免疫水平监测及流行病学调查提供了一种简单、快速、高效的血清学检测方法，为开发高品质GTPV商品化检测试剂盒奠定了基础。