一起D型产气荚膜梭菌引起小规模关中奶山羊腹泻报道

吴 克，冯 航，王 斌，王晨骁，王 娟，杨增岐

(西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

产气荚膜梭菌是一种有荚膜的革兰阳性厌氧菌，菌体呈粗短杆状[1]，广泛存在于各种动物的胃肠道中[2]；并且产气荚膜梭菌能够形成芽孢和生物膜，增强其对不利因素抵抗力，使其能够在土壤、河流等自然环境中长期生存[3-4]。

产气荚膜梭菌致病主要依靠菌体产生的蛋白毒素[5]，作为一种重要的人畜共患致病菌，产气荚膜梭菌在适宜的条件下生长繁殖迅速且能够产生20余种毒素[6]。根据对α、β、ι、ε毒素的产生能力，先前分型标准将产气荚膜梭菌分为A～E 5个毒素型[7-8]；在最新分型标准中，根据是否产生CPE和NetB毒素，F型和G型产气荚膜梭菌也被加入分型系统[9]。不同毒素型产气荚膜梭菌能够引起多种人畜疾病，A型产气荚膜梭菌可引起机体气性坏疽，F型产气荚膜梭菌能够引起人类食源性感染[10-11]；据统计，产气荚膜梭菌引起的食物中毒在美国和韩国所有食源性感染中排名第2位，在英国和法国则排在第3位[12]。除引起人类食源性感染外，B、C、D型产气荚膜梭菌也能够引起以坏死性肠炎、出血性肠炎、肠毒血症、猝死和腹泻为特征的家畜感染[13]。

据以往报道，A型产气荚膜梭菌是产气荚膜梭菌最常见的毒素型，虽然D型产气荚膜梭菌分布没有A型产气荚膜梭菌广泛，但D型产气荚膜梭菌的致病性远超A型产气荚膜梭菌；其产生的ETX毒素半数致死量为70 ng/kg，毒性仅次于肉毒毒素和破伤风毒素。并且D型产气荚膜梭菌能造成绵羊和山羊猝死、肠毒血症、神经系统和呼吸系统症状[14]。本研究自陕西省富平县某规模化羊场病羊舍11只伴随不同程度腹泻的山羊肛门拭子中均分离到D型产气荚膜梭菌。为探究此次小规模流行D型产气荚膜梭菌菌株及其在绵羊腹泻中的作用，本研究在产气荚膜梭菌分离鉴定的基础上检测了产气荚膜梭菌分离株毒素基因组成、生物膜形成能力、对常用抗生素耐药性、致病性以及对常规消毒剂的抵抗力，为产气荚膜梭菌疾病的预防和控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源11份伴随不同程度腹泻的关中奶山羊肛门拭子于2021年8月采集自陕西省富平县某规模化养殖场，拭子采集后置于运输培养基并于4℃采样箱保存，12 h内送回实验室进行细菌分离鉴定。

1.2 主要试剂和仪器细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；昆明小鼠购自西安交通大学实验动物中心；细菌培养96孔板购自广州洁特生物过滤股份有限公司；2×Taq PCR StarMix购自北京Genstar 生物科技有限公司；药品购自上海源叶生物科技有限公司；胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)培养基、厌氧肉肝汤培养基、CAMHB肉汤和普通营养琼脂购自青岛海博生物技术有限公司；厌氧培养箱购自上海新苗医疗器械制造有限公司。

1.3 产气荚膜梭菌分离鉴定将所采集的肛门拭子浸泡于1 mL无菌生理盐水，37℃静置30 min。取50 μL液体按照1∶100加入5 mL厌氧肉肝汤培养基，37℃静置培养18 h增菌。培养完成后，取1 mL 菌液3 000 r/min离心2 min，划线接种于TSC培养基，置于厌氧培养箱37℃培养24 h。挑取TSC培养基上黑色菌落接种于5%绵羊血平板进行进一步分离纯化。取血平板上单菌落生理盐水稀释煮菌后PCR扩增分离菌株16S rRNA序列并送至西安擎科泽西生物技术有限公司测序。

1.4 分离菌株毒素基因检测毒素基因cpa、cpb、etx、itx,cpe、netB、cpb2的特异引物见表1，送至西安擎科泽西生物技术有限责任公司合成。水煮法提取菌株DNA，毒素基因cpa、cpb、etx、itx采用多重PCR,50 μL反应体系：25 μL 2×Mix预混液，cpa、cpb、etx、itx毒素上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL,双蒸水补至50 μL。反应程序：94℃ 10 min；(94℃ 30 s，51.6℃ 30 s，72℃ 30 s)30个循环；72℃ 10 min。cpe、netB、cpb2采用单重PCR，20 μL反应体系：10 μL 2×Mix预混液，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL,双蒸水补至20 μL。反应程序：94℃ 10 min；(94℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min)30个循环；72℃ 10 min。

表1 毒素基因PCR引物

1.5 分离菌株耐药性检测通过微量肉汤稀释法测定产气荚膜梭菌菌株对选用抗生素的最小抑菌浓度(MIC)，在细菌用96孔板每孔加入50 μL CAMHB，并将青霉素(PEN)、氨苄西林(AMP)、四环素(TET)、多西环素(DOX)、恩诺沙星(ENR)、氟苯尼考(FFC)、磺胺异噁唑(SOX)、磺胺氯哒嗪(SCP)、克林霉素(CLI)、万古霉素(VAN)、氯霉素(CL)和链霉素(STR)进行梯度稀释。血平板上刮取产气荚膜梭菌菌落，生理盐水稀释为麦氏浊度为0.5的菌液。菌液CAMHB混合均匀，按照每孔50 μL加入96孔细菌培养板，置于厌氧培养箱37℃培养20 h。通过观察96孔细菌培养板内产气荚膜梭菌生长情况统计试验菌株对所选抗生素的MIC值。

1.6 分离菌株生物膜测定分离产气荚膜梭菌菌株接种于厌氧肉肝汤过夜培养，取过夜培养菌液使用CAMHB培养基稀释100倍后按照每孔100 μL接种于96孔细胞培养板，37℃厌氧培养24 h。培养完成后吸出孔内培养液，1% PBS清洗2次，甩出孔内剩余液体后每孔加入100 μL甲醇室温条件下固定15 min；固定完成后，吸出甲醇并置于37℃温箱风干剩余液体；1%结晶紫染色10 min后流水洗去多余结晶紫，并风干水分；每孔加入100 μL 33%醋酸37℃静置15 min溶解结晶紫后读取595 nm处D值。上述操作每株菌重复3次，D值取3次平均值；6个孔只加入100 μL CAMHB并做相同处理作为阴性对照。

1.7 小鼠致病性试验将产气荚膜梭菌分离株1∶100接种于7 mL厌氧肉肝汤培养基中，于37℃温箱过夜培养。10只小鼠随机均分为试验组和对照组，取过夜培养菌液0.2 mL/只腹腔注射攻毒试验组小鼠，对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水并于相同条件饲养。将试验组死亡小鼠与对照组小鼠进行剖检，对比观察试验组死亡小鼠的病理变化；并将病变组织器官进行常规石蜡制片和组织病理学观察。

1.8 对常规消毒剂抵抗力产气荚膜梭菌分离株接种于厌氧肉肝汤过夜培养，取2 mL菌液3 000 r/min离心5 min，使用生理盐水稀释至麦氏浊度0.5，分别使用经一定浓度稀释后的新洁尔灭、乙醇、84消毒液和浓戊二醛溶液作用10 min，然后用足量中和剂对反应进行终止(表2)。将消毒剂作用前后菌液分别以10-5稀释和原浓度涂布于TSC平板进行活菌计数，评价产气荚膜梭菌分离株对常规消毒剂的抵抗力。

表2 消毒剂及中和剂选择

2 结果

2.1 细菌分离鉴定及毒素分型分离菌株在TSC平板上为中心黑色边缘半透明菌落(图1A)，5%绵羊血平板上培养24 h后为带有双重溶血环的半透明光滑小菌落(图1B)，革兰染色镜检显示其为革兰阳性中等大小杆菌(图1C)。PCR扩增16S rRNA序列后比对显示分离菌株均为产气荚膜梭菌。本研究自11只腹泻奶山羊肛门拭子中分离得到8株产气荚膜梭菌，命名为D-1～D-8。经毒素基因检测显示8株产气荚膜梭菌均为携带毒素基因cpa和etx的D型产气荚膜梭菌，且均携带有cpb2毒素基因，结合8株产气荚膜梭菌分离自同一病羊舍8只腹泻奶山羊，初步怀疑所分离的8株产气荚膜梭菌为同一株D型产气荚膜。

图1 分离菌株形态特征观察

2.2 分离菌株耐药性及生物膜形成能力经药敏检测和生物膜形成能力测定，8株产气荚膜梭菌菌株对12种常用抗生素MIC值分布和生物膜形成能力高度一致(表3)；结合毒素基因检测显示其毒素基因组成一致，判断这8株分离于同一病羊舍的产气荚膜梭菌属于同一株D型产气荚膜梭菌。且该产气荚膜梭菌菌株对磺胺类药物(MIC >1 024 mg/L)、STR抵抗力较强(MIC ≥128 mg/L)，对TET和CL具有一定抵抗力(MIC为4～8 mg/L)，对PEN、AMP、ENR、CLI和VAN等药物抵抗力较弱(MIC<0.5 mg/L)。

表3 产气荚膜梭菌分离株耐药性检测

2.3 分离产气荚膜梭菌致病性检测该产气荚膜梭菌分离株过夜培养物腹腔注射小鼠后，试验组5只小鼠24 h内全部死亡；将试验组死亡小鼠与对照组小鼠剖检对比观察病变，发现试验组小鼠肝脏出现轻度肿大、颜色变黑，肠道出现明显臌气、出血等变化(图2)；取试验组死亡小鼠肠道内容物进行产气荚膜梭菌分离鉴定均可得D型产气荚膜梭菌。病变肠道石蜡切片观察可见死亡小鼠肠绒毛破碎、肠壁肌肉层结构变松散等病变(图3)。

A.试验组；B.对照组

A.试验组；B.对照组

2.4 分离产气荚膜梭菌对常规消毒剂抵抗力如图4所示，该D型产气荚膜梭菌经75%酒精、1∶5稀释新洁尔灭、1∶86稀释84消毒液处理10 min后被完全杀灭，但1∶3 000稀释的浓戊二醛处理后效果较差。

图4 常规消毒剂对产气荚膜梭菌分离株作用效果评价

3 讨论

关中奶山羊为陕西关中地区的乳用型山羊，具有适应性广、耐粗饲、繁殖率高、适于放牧或舍饲、乳用性能好等优点。本试验从同一病羊舍11只腹泻关中奶山羊肛门拭子分离到8株D型产气荚膜梭菌。8株产气荚膜梭菌毒素基因组成一致，对常用抗生素MIC值分布和生物膜形成能力高度一致，判断为同一株D型产气荚膜梭菌在小范围流行所致。小鼠攻毒显示该产气荚膜梭菌菌株具有致死性，且对消化系统损伤能力较强；结合奶山羊的腹泻症状，可判断此次奶山羊小规模腹泻是由1株D型产气荚膜梭菌的流行导致，且PEN、AMP、ENR、CLI等药物对其防治效果较好。对常规消毒剂抵抗力检测显示，新洁尔灭和84消毒液对该产气荚膜梭菌的作用效果良好；奶山羊生产中为防止产气荚膜梭菌的流行感染应加强对环境的机械清扫和消毒，以防止产气荚膜梭菌的区域性传播致病。