黄梁木枝叶水提物的抗菌作用及对小鼠免疫和肠道菌群的影响

李晓琳，陈 婷，丁 宁，习欠云，张永亮*

(1.华南农业大学 动物科学学院 国家生猪种业工程技术中心 广东省动物营养调控重点实验室，广东 广州 510642；2.广州海关技术中心，广东 广州 510623)

黄粱木提取物中含有生物碱、皂苷、类黄酮、烯萜、类固醇等多种活性成分[1-3]，而这些植物源的天然产物都具有一定的抗炎和抗氧化活性[4-5]，且已在植物提取物类饲料添加剂中被广泛研究。

研究显示，黄粱木叶提取物对大鼠爪子中注射角叉菜胶引起炎症性水肿具有良好的镇痛消炎作用[6-7]，其所含生物碱、三萜类、甾醇类和黄酮类化合物可能通过抑制炎症介质和前列腺素的合成而具有镇痛、抗炎作用[7]，然而，黄粱木枝叶提取物对动物免疫调节的作用及机制鲜有报道。另外，黄梁木中含有多种抗菌物质，如黄酮类、多酚类和萜类[11]；黄梁木叶热水提取物对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和黑曲霉均有显著的抗菌和抗真菌活性[5]。

天然植物抗氧化活性成分，一方面可以体现在直接清除自由基；另一方面可激活机体抗氧化酶体系。机体内抗氧化相关酶的活性和含量的变化可间接反映植物提取物对动物体内抗氧化酶系统的维护和细胞受氧化损伤程度的影响。黄粱木枝叶提取物在DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼)自由基、ABTS(2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基和超氧阴离子自由基清除等试验中均表现出体外抗氧化活性[2,8-9]。体内研究显示，黄粱木甲醇提取物具有升高埃利希腹水癌(EAC)小鼠肝脏和肾脏中过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等组织抗氧化参数，降低丙二醛(MDA)含量[10]，而缺乏黄粱木水提物对动物体内抗氧化活性的研究。

炎症免疫和氧化应激可影响肠道菌群，从而影响肠道健康。文献报道，黏液相关的厌氧和好氧肠道细菌在炎症性肠炎(IBD)中均显著增加[11]。BIAO等[12]用黄粱木叶替换金鲳鱼30%基础饲粮，结果显示黄梁木组金鲳鱼肠道内容物中在门水平上厚壁菌门显著增加(P<0.05)，在属水平乳酸菌属显著增加(P<0.05)。然而，黄梁木提取物作用于哺乳动物对肠道菌群的影响仍未见报道。

因此，本研究拟通过定量测定NCAE中化学活性成分及对部分致病性菌的体外抑菌效果，明确其功能，同时探明其对小鼠体内抗炎、抗氧化作用及对肠道菌群的影响，旨在确定NCAE活性成分及其功能，为进一步丰富黄梁木生物学价值提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料金黄色葡萄球菌(CVCC29213)、猪大肠杆菌K88(CVCC192)、猪霍乱沙门菌(CVCC503)保存于华南农业大学动物科学学院。4周龄(20 ±2)g SPF级昆明小鼠(KM鼠)雄鼠24只，由广东省医学实验动物中心提供。植物提取所用黄梁木于2017年 6 月采自华南农业大学稻香园黄梁木种植基地，经华南农业大学林学院陈晓阳教授鉴定为黄梁木(Neolamarckiacadamba(Roxb.)Bosser)。

1.2 黄梁木水提物制备及活性物质测定将新鲜黄梁木树叶和树枝置于阴凉通风处，然后置 50℃烘箱烘干，粉碎，过40目筛，密封保存。干粉和蒸馏水按照1∶25比例混合，搅拌均匀后静止30 min，加热使其沸腾30 min，过滤，滤渣加入等量蒸馏水，再次沸腾30 min，过滤得到滤液，合并2次滤液。旋转蒸发浓缩后于50℃烘箱烘干，得NCAE干膏。

将所得干膏以蒸馏水稀释，配置质量浓度为1 g/L 的待测溶液。以葡萄糖为标准品于490 nm处测定样品多糖含量；以芦丁为标准品于510 nm处测定样品黄酮含量；以没食子酸为标准品于760 nm 处测定样品总酚含量；以熊果酸为标准品于546 nm处测定样品三萜皂苷含量。每个指标中待测溶液设3个平行，结果取平均值。

1.3 抑菌药物处理将黄梁木树叶、枝叶和树枝的水提物浸膏溶于10%二甲基亚砜(DMSO)，配置质量浓度为0.1 g/mL的供试药液，经121℃高压蒸汽灭菌后置于4℃保存备用。

1.4 菌液制备-80℃保存的菌株冻存管于37℃水浴直至结冰完全溶解，在无菌操作下吸取50 μL菌液，滴入凝固后HM琼脂培养基，以涂布法接种于培养基，于37℃培养箱中培养24 h。挑取培养基上单独菌苔到灭菌生理盐水配置菌悬液，根据麦氏比浊法使其浓度调整为106CFU/mL。

1.5 MIC试验使用96孔微量稀释法测定药液MIC值，并以INT指示剂(碘硝基四唑紫)与细菌变色反应作为判定依据。孔内先后加入MH肉汤、药液、菌液后置于37℃培养箱中培养24 h，再加入INT指示剂孵育2 h，观察孔内是否出现变红现象。将未出现红色的孔中混合液接种到HM琼脂培养基上，37℃培养24 h，若培养皿中菌落数量少于5则认为该孔对应药液浓度作为MBC值。

1.6 动物试验及组织样品采集24只小鼠随机分成3组，每组8只，空白组饲喂正常维持饲粮，黄梁木组饲喂维持料+ 3 g/kg NCAE的饲粮，抗生素组饲喂维持料+ 0.01 g/kg庆大霉素(GEN)的饲粮，试验期为2周。试验结束后，采用摘眼球法收集小鼠血液，2 000 r/min离心15 min后吸取上清得到血清样品，采用断颈法处死小鼠，并采集脾脏和肾脏组织。

按照CAT、MDA、SOD、IL-2、IL-6、TNF-α试剂盒测定方法进行抗炎及抗氧化指标测定(购自广州源满生物技术有限公司)。

1.7 肠道菌群测定无菌操作取小鼠盲肠内容物后置于-80℃保存，由北京百迈客生物技术有限公司测序。分析报告把优化后的序列进行操作分类单元(OUT)聚类(相似水平为97%)，之后采用RDP classifer对菌种进行分类，并在各分类水平统计每个样本的菌群组成；采用Qimme软件进行Alpha多样性分析；采用基于Unweighted_unifrac的热图分析对粪便样品微生物组成的组间距离进行分析；采用Metastats算法(T检验)对各分类水平物种差异菌种进行组间差异显著性分析。

2 结果

2.1 黄梁木提取物化学活性成分分析如表1所示，在黄梁木树枝、树叶、树枝水提物中均检测到多糖、黄酮、总酚、三萜皂苷的存在，树枝、枝叶、树叶多糖含量分别为21.34%，28.81%，32.49%；黄酮含量分别为2.30%，2.87%，1.19%；总酚含量分别为0.28%，0.50%，0.36%；三萜皂苷含量分别为1.56%，0.79%，0.52%。通过对比发现，黄梁木树枝水提物中三萜皂苷含量较高；枝叶水提物中黄酮、总酚含量较高；树叶水提物中多糖含量较高。

表1 NCAE中化学成分的测定

2.2 黄梁木提取物抗菌活性研究结果显示，黄梁木枝叶水提物对金黄色葡萄球菌、猪大肠杆菌、猪霍乱沙门菌均显示出抑菌活性，其中黄梁木树枝水提物对金黄色葡萄球菌抑菌效果最佳，达6.25 g/L(表2)。

表2 NCAE对细菌的MIC值和MBC值 g/L

2.3 黄梁木提取物对小鼠免疫因子的影响多糖、黄酮和酚类已被大量文献报道具有抗氧化和抗炎活性[13-17]，结果显示，黄梁木枝叶水提物中黄酮和酚类物质含量较高，故选取枝叶水提物进行动物试验(表1)。由图1可见，各试验组血清、脾脏及肾脏中IL-2含量无差异(P>0.05，图1A)；与空白组相比，黄梁木组和抗生素组IL-6的含量均显著下降(P<0.05，图1B)；黄梁木组和抗生素组血清和肾脏中TNF-α含量显著下降(P<0.05，图1C)，而脾脏组织中TNF-α含量无差异(P>0.05,图1C)。与抗生素组相比，黄梁木组各器官中IL-2、IL-6及TNF-α含量均无显著性差异(P>0.05，图1)，结果提示NCAE有抑制炎症因子的作用。

注：无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同

2.4 黄梁木提取物对小鼠抗氧化功能的影响结果显示，与空白组相比，黄梁木组和抗生素组脾脏和肾脏中CAT含量显著升高(P<0.05，图2A)；黄梁木组和抗生素组血清和肾脏中MDA含量均显著下降(P<0.05)，同时黄梁木组脾脏中MDA含量显著下降(P<0.05，图2B)；在各组织器官中，相比于空白组，抗生素组中SOD含量显著升高(P<0.05)，而黄梁木组中SOD含量无显著变化(P>0.05，图2C)。且与抗生素组相比，黄梁木组各器官中CAT、MDA及SOD含量均无显著性差异(P>0.05)，结果提示NCAE在体内有良好的抗氧化活性。

图2 小鼠血清、脾脏和肾脏的抗氧化相关因子含量

2.5 黄粱木提取物对肠道菌群的影响

2.5.1小鼠盲肠内容物菌群Alpha多样性分析 从表3可知，NCAE可提高Alpha多样性指数中OUT、Chao1、ACE指数和Shannon指数值，其中黄粱木组OUT显著(P<0.05)高于空白组且Chao1显著(P<0.05)高于抗生素组，而抗生素组的ACE指数和Chao1均呈下降趋势。结果表明相对于空白组，黄梁木组小鼠盲肠菌群种类显著提高(P<0.05)；而相对于抗生素组，黄梁木组小鼠盲肠菌群物种丰度显著提高(P<0.05)。

表3 Alpha多样性指数统计

2.5.2小鼠盲肠内容物菌群Bate多样性分析 由图3可见，同组内小鼠肠道菌群相似度高(A1、A2、A3区域)而不同组间存在不同程度的差异(B1、C1、C2区域)，其中抗生素组与空白组间相似度低(B1区域)，而黄梁木组显示出与空白组较高的相似度(C2区域)。结果表明，抗生素易导致肠道菌群紊乱，而NCAE对维护肠道菌群稳态具有一定的积极作用。

本图为对称图形，左下三角形与右上三角形完全对称，共同组成丰度热图，其中GEN(抗生素组)n=4，control(空白组)n=4，cadamba(黄梁木组)n=8；颜色梯度由蓝色到红色表示样品间距离由近到远，即相似度由高到低

2.5.3小鼠盲肠内容物菌群相对丰度的差异 结果显示，厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门等肠道优势菌门占肠道微生物的95%以上，而各组样品中这3种优势菌门占比无显著变化(图4A)。各组小鼠盲肠中微生物的菌群结构的影响主要体现在属水平上，与空白组相比，黄梁木组拟杆菌科S24-7组、毛螺菌科NK4A136组、脱硫弧菌属、另枝菌属、瘤胃梭菌属的占比有增加趋势，而毛螺菌属科、拟杆菌属、拟普雷沃菌属、罗氏菌属、葡萄球菌属的占比呈减少趋势(图4B)。结果表明，NCAE具有改变肠道微生物菌群结构的能力。

A.门水平柱状图；B.属水平柱状图；相对丰度<1%的肠道菌群作为其他菌群纳入；不同颜色代表不同的肠道细菌；纵坐标百分比表示肠道细菌的相对丰度

3 讨论

GANJEWALA等[18]在黄梁木叶不同溶剂的提取物均检测到类黄酮的存在；有报道酚类和萜类均在黄梁木枝叶水提物中存在[3,8]。其中，黄粱木茎和茎皮中含有柚皮素、无色花青素、槲皮素、芹菜素、樱黄素等黄酮类化合物；叶和根中含有熊果酸等萜类物质[19]。本试验从NCAE中检测到有多糖、黄酮、总酚和三萜皂苷的存在，与报道结果相似[3,20-22]。活性成分含量结果显示，黄梁木树枝水提物中三萜皂苷含量较高；枝叶水提物中黄酮、总酚含量较高；树叶水提物中多糖含量较高，表明该水提方法下，不同部位获得的活性成分含量存在差异，在后期研究中应根据试验目的选择合适的方法和部位进行活性成分提取。

有研究表明，黄梁木叶热水提取物对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓假单胞菌和黑曲霉均有显著的抗菌和抗真菌活性[3]，本试验结果也发现NCAE对金黄色葡萄球菌、猪大肠杆菌、猪霍乱沙门菌显示出抑菌活性。说明黄粱木提取物对革兰阳性和阴性细菌、真菌均有一定的抑制作用，展示出其替代饲用抗生素抑菌方面的潜力。

IL-6被称为细胞因子的核心成员，主要免疫学功能是加强其他细胞因子的免疫调节作用。TNF-α 是迄今为止发现的具有抗肿瘤和炎症作用最强的细胞因子[23]。黄梁木的体外抗炎作用已有报道[24-26]，而体内抗炎作用也被证实[6-7]。同时，黄梁木叶热水提取物显著增加大鼠血清中IL-2的水平[25]。本试验结果表明，NCAE能显著降低小鼠体内促炎因子IL-6和TNF-α的含量而发挥抗炎作用。有研究表明，苦丁茶多酚、黄酮类化合物的抗炎活性也是通过抑制IL-6和TNF-α的产生而实现的[27-28]。

SOD、CAT和GSH-Px体内抗氧化防御网络的第一道防御，可消除活性氧[29]。MDA是氧化应激条件下多不饱和脂质过氧化反应的终产物[30]，可以作为衡量氧化应激的程度。植物中含有的多糖、黄酮、酚类等物质均具有抗氧化活性。黄梁木花顶乙醇提取物能显著提高四氧嘧啶诱导糖尿病大鼠血液中CAT的含量[31]，而黄粱木甲醇提取物可提高小鼠肝脏和肾脏中CAT、SOD和GSH-Px等组织抗氧化参数，降低MDA含量[10]。本试验中NACE能显著提高小鼠血清、脾脏和肾脏组织中CAT的含量同时降低MDA的含量，再次确定了黄梁木提取物有提高机体抗氧化能力的作用。

据报道，黄梁木具有抗腹泻的作用[32]，本试验已证实NCAE对可导致动物腹泻的有害菌如金黄色葡萄球菌、猪大肠杆菌、猪霍乱沙门菌的生长有一定的抑制作用。肠道菌群的组成在新陈代谢和炎症的背景下是宿主健康的关键决定因素[33]。

肠道菌群丰富是肠道健康的标志之一，NCAE可提高Alpha多样性指数中OUT、Chao1、ACE指数和Shannon指数值，而抗生素组ACE和Chao1值均低于空白组。广谱抗菌药物对肠道菌群的抑制可能促进了耐药性病原体的定植或感染风险[34]，ZHOU等[35]研究表明土霉素可降低斑马鱼肠道菌群多样性，更严重的后果是增加耐药基因在肠微生物群中的传播和富集[36]。

研究表明，植物提取物中的多糖、酚类可影响肠道菌群多样性以及调节动物病理状态如高脂和炎症，同时存在与肠道细菌的互作作用。0.2%茶多酚可恢复高脂饮食造成的肠道菌群多样性下降[37]，菊花多糖对溃疡性结肠炎(UC)通过调节肠道微生物面发挥保护作用[38]。在本试验中，NCAE对生理状态下的小鼠显示出了增加肠道菌群丰度及多样性的效果，提示NCAE可能具有调节肠道菌群类的潜力。其中，NCAE增加小鼠肠道菌群丰度及多样性的能力和抗炎能力之间是否存在相互作用还有待进一步研究。

添加剂摄入可引起肠道菌群变化。Beta多样性(Beta diversity)分析可以比较不同样品在物种多样性方面存在的相似程度。本研究同组内小鼠肠道菌群相似度高而不同组间存在不同程度的差异，抗生素组与空白组相似度低。研究表明，单一抗生素可引起肠道菌群失调，从而导致细菌移位[39]，多种抗生素可通过改变肠道微生物群的组成来影响宿主动物的免疫反应[40]，且在抗生素暴露后，肠道菌群的正常组成需要很长时间才能恢复[41]。本研究中，黄梁木组与空白组组间相似度较高，BIAO等[12]通过高通量测序分析得到相似结论，用黄梁木叶替换30%的基础饲粮组和未替换基础饲粮组在金鲳鱼肠道细菌聚类上显示出较高的相似性。以上结果表明，抗生素的使用易对动物肠道健康产生不利影响，而黄梁木对维护肠道微环境稳态有一定的积极作用。

本研究中，NCAE对盲肠中微生物的菌群结构的影响主要体现在属水平上，与空白组相比，黄梁木组不可培养拟杆菌科S24-7组、毛螺菌科NK4A136组、脱硫弧菌属、另枝菌属、瘤胃梭菌属的占比有增加趋势，而不可培养毛螺菌属科、拟杆菌属、拟普雷沃菌属、罗氏菌属、葡萄球菌属的占比呈减少趋势。有报道指出，黑枸杞饮食使小鼠粪便中不可培养拟杆菌科S24-7组、另枝菌属升高而拟杆菌属和拟普雷沃菌属下降，并改善微生物群的丰富度和多样性[42]。机体炎症可能与微生物多样性变化有关，其中另枝菌属和毛螺菌科含量的降低和拟普雷沃菌属水平的升高是其表现之一。沙门菌致炎症模型中微生物的总体多样性显著降低，主要是由另枝菌属和毛螺菌科的减少引起的，而炎症与肠杆菌科和乳酸菌科呈正相关[43]。拟普雷沃菌属最终产物为琥珀酸和乙酸，两者高浓度的条件下均可引起炎症、组织损伤，甚至诱导结肠炎的发生[44]。毛螺菌科参与单糖发酵成丁酸盐过程[45]，而丁酸盐可改善肠道黏膜完整性和激活肠道PPAR-γ通路，维护肠道健康[46]。金黄色葡萄球菌是重要的肠道致病菌，本研究中发现抗生素组中致病菌葡萄球菌属的含量显著降低，而该菌在黄梁木组则有下降趋势，这与NCAE对金黄色葡萄球菌显示出的体外抑制作用结果相符。综上所述，NCAE的添加显著提高了小鼠肠道菌群丰富度，同时黄梁木组与空白组属水平上的菌群差异提示前者可能在预防肠道炎症疾病和降低肠道致病菌两方面起促进肠道健康的作用。

NCAE含有多糖、黄酮、总酚和三萜皂苷等活性成分，能一定程度上抑制金黄色葡萄球菌、猪大肠杆菌和猪霍乱沙门菌的生长。同时，NCAE能降低鼠血清、脾脏和肾脏促炎因子IL-6、TNF-α的含量和提高抗氧化因子CAT的含量，具有抗炎和抗氧化活性。此外，饲粮中添加NCAE能增加小鼠盲肠菌群丰富度，有利于维护肠道菌群稳态。