番茄红素、菟丝子和泰山磐石散缓解玉米赤霉烯酮对孕鼠生殖毒性的作用

康俊港，李 杨，姜国均，王亚博，马占飞

(河北农业大学 动物医学院，河北 保定 071000)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)又称F-2毒素，是一种由镰刀菌属真菌产生的非甾体雌激素真菌毒素，是真菌产生的次生代谢产物。全世界每年约有25%的谷物会遭受霉菌毒素的污染，其污染已成为世界性公共安全问题。ZEA具有类雌激素作用，对畜禽的生殖系统具有破坏作用。其污染状况对畜牧业产生极大的威胁，严重影响了我国畜牧业的健康发展。

番茄红素是植物性食物中存在的一种类胡萝卜素，具有抗炎、抗凋亡和抗氧化作用[1]。研究表明，番茄红素可以拮抗邻苯二甲酸二丁酯所致果蝇的生殖毒性，包括果蝇生育率、生育期、生育数和子代存活率[2]。番茄红素可以缓解环境雌激素全氟辛酸引起的生殖障碍和肝损伤[3]。KANG等[4]研究发现,番茄红素可通过防止氧化应激、线粒体功能障碍和细胞凋亡对猪体外受精胚胎的发育起有益作用。

菟丝子是纯天然药用植物，其最有效成分为菟丝子黄酮具有滋补肝肾、保胎的功效，具有温而不燥、补而不滞的特点。菟丝子可以通过调控下丘脑-垂体-性腺轴来调节生殖内分泌活动[5]，在改善应激大鼠卵巢内分泌功能，降低流产模型的流产率，预防氧化应激引起的生精细胞损伤以及阻滞细胞凋亡等方面发挥着重要作用[6]。此外，有研究表明，菟丝子黄酮具有抗凋亡作用[7-8]。

泰山磐石散为补益剂，具有益气健脾，养血安胎之功效。高晓雷等[9]研究表明，泰山磐石散可以调节雌二醇(E2)、孕酮(P)和雌激素受体(ER)来降低流产率。另有研究表明，泰山磐石散能使复发性流产小鼠降低胚胎流失率，发挥免疫防护作用，有利于妊娠继续[10]。杨乃喜等[11]研究发现，给妊娠期母鼠饲喂泰山磐石散，能够提高仔鼠的生长性能，提高仔鼠抗炎性损伤能力，降低仔鼠的腹泻率。

3种中药能否缓解ZEA引发的生殖毒性尚未见报道。本试验通过对孕鼠灌胃ZEA及中药后，检测分析孕鼠子宫形态、生殖激素和细胞凋亡因子表达水平的变化，探究ZEA的毒性损伤及中药的缓解作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料ZEA购自上海皓鸿生物医药科技有限公司，纯度保证值为97%；番茄红素购自上海源叶生物科技有限公司，纯度为80%；菟丝子黄酮购自西安开来生物工程有限公司，纯度为90%；泰山磐石散购自杨凌正大生物科技有限公司。

1.2 实验动物饲养管理及分组昆明系8周龄雌性小鼠、9周龄雄性小鼠，购自北京斯贝福实验动物中心，许可证号：SCXK(京)2019-0010。雌鼠4只1笼，雄鼠1只1笼。试验期间自由饮水和采食，室温19～22℃，通风良好，常规饲养。

第3天后，雌鼠∶雄鼠2∶1合笼过夜，次日清晨检查出阴栓者，定为孕0 d，孕鼠均单笼饲喂。将未孕小鼠转到原笼，傍晚再与雄鼠合笼过夜，直至检出阴栓。将妊娠小鼠随机分为5组，每组12只，设3个重复，每个重复4只。A组为对照组；B组为模型组，C组为番茄红素组，D组为菟丝子黄酮组，E组为泰山磐石散组。孕0 d上午，A组灌胃蒸馏水0.2 mL，B、C、D、E组均灌胃5 mg/kg ZEA 0.2 mL；下午A、B组灌胃蒸馏水0.2 mL，C组灌胃20 mg/kg 番茄红素0.2 mL，D组用灌胃10 mg/kg 菟丝子黄酮0.2 mL，E组灌胃1 g/mL泰山磐石散0.2 mL。各组试验鼠于孕第11天剖杀，记录体质量和流产数。

1.3 样品采集和指标测定

1.3.1样品采集 孕第11天，眼球摘除采血，37℃培养箱静置1 h，3 000 r/min离心10 min，取血清-20℃ 保存备用。脱颈处死小鼠，取子宫，放入4℃保存的生理盐水中，记录胚胎数，剥离胎儿及胎盘，称量子宫净重。然后取子宫中段固定于4%甲醛溶液中；其余部分锡纸包裹放入封装袋，-80℃保存备用。

1.3.2生殖激素水平分析 血清和子宫中E2、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、P等生殖激素采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定。E2试剂盒、FSH试剂盒、LH试剂盒和P 试剂盒均购自东莞酶联生物科技有限公司。

1.3.3子宫石蜡切片的制作 对4%甲醛浸泡后的子宫组织进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片、镜检。

1.3.4实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法测定子宫中凋亡因子mRNA的表达 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成以下引物序列：Bax上、下游引物：5′-TTGCCCTCTTCTACTTTGCTAG-3′，5′-CCATGATGGTTCTGATCAGCTC-3′;Bcl-2上、下游引物：5′-AGGCTCTCTGCACCATCACTT-3′,5′-CTCTGGGTTGGGTCTGTGTTC-3′;Caspa-se-3上、下游引物：5′-GAAACTCTTCATCATTCAGGCC-3′，5′-GCGAGTGAGAATGTGCATAAAT-3′;Caspase-8上、下游引物5′-ACCAAATGAAGAACAAACCTCG-3′，5′-CTTCATTTTT-CGGAGTTGGGTT-3′。

将干粉引物10 000 r/min离心1 min，使其落入管底部，加入无菌无酶水稀释到10 μmol/L，备用。取40 mg、-80℃保存的子宫组织，按照试剂盒说明提取总RNA，合成cDNA。将所得cDNA按照RT-qPCR试剂盒说明进行操作。

2 结果

2.1 ZEA对孕鼠生长性能及流产率的影响及中药的缓解作用妊娠第11天，相比A组，B组孕鼠末体质量极显著降低(P<0.01)，平均日增体质量也极显著降低(P<0.01)，流产率极显著升高(P<0.01)；C组末体质量显著降低(P<0.05)，平均日增体质量和流产率差异不显著(P>0.05)；D、E组末体质量极显著降低(P<0.01)，D组平均日增体质量显著降低(P<0.05)，流产率极显著升高(P<0.01)；E组平均日增体质量极显著降低(P<0.01)，流产率差异不显著(P>0.05)。与B组相比，C、D、E组末体质量无显著性差异(P>0.05)，C组平均日增体质量显著升高(P<0.05)，流产率极显著降低(P<0.01)；D、E组平均日增体质量差异不显著(P>0.05)，流产率极显著降低(P<0.01)。结果详见表1。

表1 妊娠小鼠生长性能及流产率

2.2 ZEA对妊娠小鼠子宫形态结构的影响及中药的缓解作用孕鼠妊娠期开始灌喂5 mg/kg ZEA后，对子宫产生严重损伤。A组(对照组)子宫内膜呈绒毛状突起，组织结构完整，形态清晰，而B组(模型组)子宫内膜内陷，固有层水肿，结缔组织排列疏松，结构紊乱。C、D、E组相对清晰完整，可见给予中药有一定的缓解作用(图1)。

A～E.对照组、模型组、番茄红素组、菟丝子黄酮组、泰山磐石散组

2.3 ZEA对妊娠小鼠生殖激素水平的影响及中药的缓解作用

2.3.1妊娠小鼠血清生殖激素水平及中药的缓解作用 与A组相比，B组的E2、FSH和P含量极显著升高(P<0.01)，而LH的含量极显著降低(P<0.01)，C、D、E组的E2和LH的含量差异不显著(P>0.05)，C、D组FSH的含量极显著升高(P<0.01)，P的含量显著升高(P<0.05)；与B组相比，C、D、E组E2的含量显著降低(P<0.05)，FSH的含量极显著降低(P<0.01)，C组LH水平显著升高(P<0.05)，C、D组P的含量差异不显著(P>0.05)，D、E组LH的含量极显著升高(P<0.01)，E组P的含量显著降低(P<0.05)(图2)。

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)；相同字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.3.2妊娠小鼠子宫匀浆生殖激素水平及中药的缓解作用 与A组相比，B组的E2、FSH、P的含量均极显著升高(P<0.01)，而LH的含量极显著降低(P<0.01)，C、D、E组的E2、FSH、LH和P的含量差异不显著(P>0.05)；与B组相比，C、D组E2、FSH和P的含量显著降低(P<0.05)，LH的含量显著升高(P<0.05)，E组E2、FSH和P的含量极显著降低(P<0.05)，E组LH水平极显著升高(P<0.01)(图3)。

图3 妊娠小鼠子宫匀浆生殖激素的含量变化

2.4 ZEA对妊娠小鼠子宫凋亡相关因子的影响及中药的缓解作用凋亡因子的mRNA相对表达量，与A组相比，B组子宫Bax、Caspase-3和Caspase-8 mRNA相对表达量均极显著升高(P<0.01)，Bcl-2 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)，C、D、E组子宫Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-8 mRNA相对表达量均与A组相近(P>0.05)；与B组相比，C、D组Bax和Caspase-3 mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)，Bcl-2 mRNA相对表达量显著升高(P<0.05)，Caspase-8 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)；D组Bcl-2和Caspase-3差异不显著(P>0.05)；E组Bax mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)，Bcl-2和Caspase-8 mRNA相对表达量相近(P>0.05)，Caspase-3 mRNA相对表达量极显著降低(P<0.01)(图4)。

图4 ZEA对妊娠期小鼠子宫凋亡相关基因相对表达量的影响

3 讨论

近年来，霉菌毒素的污染日益严重，同时我国严禁在饲料中添加激素类药物，用中药解决ZEA污染问题成为重要选项之一。本试验通过灌服中药成分和中药方，探讨其对ZEA引起生殖毒性的缓解作用。

子宫是母鼠重要的生殖器官，在激素分泌和胚胎附植过程中起到重要作用，而ZEA正是以雌性动物生殖系统作为主要靶器官。子宫的功能状态直接影响母鼠的繁殖机能。王相生[12]研究表明，母猪妊娠期饲粮中含有微量ZEA可显著降低胎儿数，提高产弱仔猪发生率；王丙雷等[13]研究发现，不同浓度ZEA的摄入可以导致雌性小鼠子宫增生和上皮内陷。孕期检测平均日增体质量可以间接反映胚胎发育情况和孕鼠的繁殖性能。本试验结果显示，B组的平均日增体质量显著低于A组，流产率也高于对照组，子宫内膜增生，固有层水肿，说明ZEA对孕鼠产生生殖毒性，对子宫造成损伤，造模成功。在KUNISHIGE等[14]关于ZEA作用于早期妊娠小鼠的研究中，ZEA 通过影响输卵管中胚胎的运输和延迟胚胎发育，干扰胚胎附植过程，探索了ZEA致流产的机理。本试验发现，使用番茄红素等中药后，平均日增重升高，流产率降低，子宫内膜未增生，固有层轻微水肿。杨柳[3]研究表明，番茄红素可以提高妊娠小鼠平均子宫质量，可能是拮抗了全氟辛酸对胚胎生长发育的抑制作用；菟丝子黄酮能够通过增加滋养细胞MMP9的表达来增加滋养细胞迁移和侵袭能力，同时激活MAPK、AKT和Notch信号通路的相互信号传导发挥预防治疗流产作用[15]；泰山磐石散通过抑制NF-κB的活化、降低促炎细胞因子的合成和释放来防治自然流产[16]；这与本试验番茄红素、菟丝子黄酮和泰山磐石散能够降低流产率结果相一致，但对降低ZEA染毒流产率的机制需进一步研究。

下丘脑-垂体-性腺轴分泌的E2、FSH、LH和P共同调控动物体生殖内分泌活动。本试验结果显示，与A组相比，B组的E2、FSH和P含量极显著升高(P<0.01)，而LH的含量极显著降低(P<0.01)。E2的主要作用为促进雌性生殖器官的发育，这可能是本试验子宫内膜增生的原因，E2的含量变化与KUNISHIGE等[13]的研究结果一致。FSH可以促进卵泡发育，与LH协同作用促进雌激素的分泌。有研究表明，ZEA可以增加FSH水平[17-18]；NAKAMURA等[19]研究证实，ZEA及其所有代谢物在体外通过G蛋白偶联受体30抑制来自牛垂体前叶细胞的LH分泌，均与本试验结果一致，这可能与本试验中E2和P的升高负反馈调节了LH的分泌，导致LH水平的降低。P是卵巢黄体分泌的一种天然孕激素，是维持妊娠的重要保证，ZEA会导致P水平降低，进而影响妊娠过程。VANCE等[20]对摄入3个发情周期的妊娠母马血清P含量进行检测，也是升高的，结果与本试验模型组相同；但在王相生等[21]的研究中，饲喂添加ZEA饲粮的妊娠母猪血清P含量显著高于对照组；导致此结果的原因目前还不清楚，这可能与正处在妊娠期有关，但具体机制还要进一步验证。本试验发现，与B组相比，C、D组E2、FSH和P的含量显著降低(P<0.05)，LH的含量显著升高(P<0.05)，E组E2、FSH和P的含量极显著降低(P<0.05)，E组LH水平极显著升高(P<0.01)。有研究表明，番茄红素和菟丝子黄酮升高了由双酚A染毒的子代雌鼠LH水平，降低了E2生殖激素水平[22]；菟丝子黄酮能够调控下丘脑-垂体-性腺轴来维持生殖激素的稳态[5]；泰山磐石散可以调节流产模型大鼠外周血E2和P含量[9]；这表明3种中药都可以调控生殖激素水平，并与本试验结果相一致，表明番茄红素等中药可以对ZEA引起的生殖激素紊乱起到一定的逆转作用。

众所周知，Bax/Bcl-2的变化对细胞凋亡有显著影响，一切促进或抑制凋亡基因对细胞凋亡的影响，最终归结为Bax/Bcl-2比值的变化。研究表明，ZEA介导的细胞凋亡作用是ZEA上调促凋亡基因Bax表达，同时下调促凋亡基因Bcl-2表达[23-24]；Caspase-8和Caspase-3是Caspase酶家族成员，分别处于Caspase凋亡传导通路的上、下游。Caspase-8是重要的凋亡启动因子，而Caspase-3为凋亡的关键效应酶。ZEA可以通过上调Caspase-3和Caspase-8的表达从而引起子宫内膜细胞凋亡[25]，与本试验结果一致，说明ZEA能够通过Caspase-8这条途径引起细胞凋亡，进而对子宫造成损伤，产生生殖毒性。有研究表明，番茄红素通过抑制细胞内ROS的产生，改善线粒体膜电位，减少细胞色素C的释放和Caspase-3的激活，从而减少体外猪胚胎细胞凋亡[4]；菟丝子黄酮可以通过降低凋亡蛋白Bax，升高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达抑制平滑肌细胞的凋亡[26]；泰山磐石散能够通过降低TNFα-TNFR1信号通路相关凋亡蛋白(Caspase-3、Caspase-8)来治疗流产[27]。本试验凋亡基因检测结果说明3种中药能够缓解ZEA引起的细胞凋亡。

综上所述，ZEA可以通过使生殖激素紊乱，子宫细胞凋亡对孕鼠产生毒性作用，而3种中药可以缓解其毒性，其中泰山磐石散作用效果最好。