内生真菌对藤茶二氢杨梅素和杨梅素积累的影响

周防震，龚琪雯，周 志1,，陈梦洁，汤克立

1. 硒食品营养与健康智能技术湖北省工程研究中心，湖北 恩施 445000；2. 湖北民族大学 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000

藤茶（Amepelopsis grossedentata），是葡萄科蛇葡萄属的一种野生藤本植物，是一种非常古老的中草药资源、类茶植物资源和药食两用植物资源[1]。二氢杨梅素是藤茶的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗突变、止咳、化痰和抗菌等多种生理活性[2]。研究显示，藤茶幼嫩茎叶中二氢杨梅素含量可以高达30%以上，但其合成积累的机制尚不清楚。

许多研究已经观察到内生真菌与植物次生代谢成分的联系，指出内生真菌能够直接或间接地影响植物的次生代谢过程，引起植物的次生代谢产物发生变化[3]。目前国内外有关植物内生真菌及其次生代谢产物的研究较多，但藤茶内生真菌对其主要次生代谢产物二氢杨梅素积累的影响方面的研究尚未见报道。本试验从内生真菌的角度探讨了内生真菌对藤茶二氢杨梅素和杨梅素积累的影响，以期为揭示藤茶次生代谢产物二氢杨梅素的合成机制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藤茶成熟浆果和待分离内生真菌的藤茶叶片样本分别于2019年9月和10月采集于恩施市七里坪藤茶基地。引物ITS 1（5'-TCCGTAGGTG AACCTGCGG-3'）和 ITS 4（5'-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'）由上海英骏生物技术有限公司合成。改良马丁培养基（真菌培养基）购于杭州微生物试剂有限公司；NaClO购于武汉市中天化工有限责任公司；Taq DNA聚合酶购于TAKARA公司；二氢杨梅素和杨梅素标准品（HPLC，＞99%）购于北京索莱宝科技有限公司；其他试剂购于国药集团。

1.2 主要仪器

ABI-2720 PCR扩增仪，Bio-rad凝胶成像系统，TECAN Infinite-M200多功能酶标仪。

1.3 试验方法

1.3.1 藤茶内生真菌的分离

用无菌水将藤茶叶片表面冲洗干净，用75%的酒精浸泡2 min，用无菌水冲洗3次，5%次氯酸钠处理10 min，无菌水冲洗3次。将藤茶叶片接种到PDA培养基上，置于37℃恒温箱中培养48 h。挑取菌丝接种到改良马丁培养基上纯化培养。挑取菌落边缘菌丝转接于分离培养基平板，得到藤茶叶源优势内生真菌的纯培养体。

1.3.2 内生真菌的基因组提取

称取少量的菌丝体（约0.04 g）；加入0.5 mL1.5 %（w/v）CTAB抽提液在预冷研钵中充分研磨；将研磨液转入1.5 mL离心管中，立即置于65℃水浴10 min；加入200 μL乙酸铵（10 M），冰浴8 min；12000 r/min离心10 min；吸取上层水相至另一1.5 mL离心管中，加入0.5～ 0.6倍体积的冰预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置15 min；12000 r/min离心15 min，弃上清，75%乙醇洗涤两次，自然晾干，加入适量ddH2O，放入-20℃冰箱保存，待用。

1.3.3 ITS序列扩增

取2 mLEppendorf管，在其中添加以下各种反应液：ddH2O 7 μL、模板DNA 2 μL、上下游引物各0.5 μL、Taq DNA聚合酶（含dNTP混合物）10 μL、总体积20 μL；PCR扩增程序如下：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 1 min，72℃ 30 S，30个循环，72℃延伸10 min，4℃保存。琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物；PCR扩增的产物送生工生物工程（上海）股份有限公司武汉分公司进行ITS序列测定。

1.3.4 藤茶实生苗繁育及移栽

将藤茶种子按常规方法育苗，待实生苗长度在4 ～ 7 cm时移入大田，5周后进行内生真菌处理；晴天早晚各浇水1次。

1.3.5 内生真菌孢子悬液的制备及田间试验

血球计数板计数后，将内生真菌孢子悬液调整为高、低浓度两组，其浓度分别为5.16×106CFU/mL和2.58×106CFU/mL。藤茶实生苗共分9个处理，分别为生理盐水对照组、高/低浓度叶面喷施组、高/低浓度根际灌施组、高/低浓度灭活菌液叶面喷施组以及高/低浓度灭活菌液根际灌施组，每组4株藤茶。其中灌施均使用50 mL悬液, 而喷施以叶面有液滴滴落为标准。

1.3.6 藤茶二氢杨梅素含量的测定

内生真菌处理一个月后，收集藤茶茎端至下方4层叶片，60℃干燥至恒重，研钵充分研磨待用。精确称取研磨后的藤茶0.5 g加入20 mL甲醇，超声提取10 min，倒出提取液，重复操作1次，合并提取液置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，过滤，弃去初滤液10 mL；精密量取续滤液5 mL置50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。利用多功能酶标仪分别于291 nm和373 nm处测定吸光值，结合标准曲线的绘制，计算供试品中二氢杨梅素和杨梅素的含量。

2 结果与分析

2.1 内生真菌分离结果

分离得到一株藤茶叶源优势内生真菌LZC-2，在PDA培养基上培养1周以上，可见大量分生孢子（图1），光学显微镜下可见明显分生孢子梗和顶囊等结构。将LZC-2分生孢子接种至改良马丁液体培养基可形成明显的菌丝球（图2）。

图1 PDA培养基上LZC-2形态Figure 1 Morphology of LZC-2 on PDA medium

2.2 内生真菌分子鉴定结果

分离纯化得到的内生真菌LZC-2，经基因组提取，进行琼脂糖凝胶电泳。该基因大小在10 Kb以上（图3），表明该基因组DNA提取成功。对LZC-2的rDNA-ITS序列进行PCR扩增，电泳检测结果显示该基因片段大小为500 bp左右，符合真菌通用引物扩增ITS基因序列片段的大小。将扩增出来的ITS序列测序，发现其片段长度为572 bp（图4），测序结果与NCBI数据库进行BLAST比对和系统进化树分析，发现内生真菌LZC-2与烟曲霉菌最为相似，NCBI登录号为MW578364.1。

图4 ITS序列扩增片段电泳图Figure 4 Electrophorogram of ITS sequence amplified fragment

2.3 内生真菌对藤茶二氢杨梅素含量的影响

二氢杨梅素浓度在13.5 ～ 108 mg/L，浓度与吸光值间有良好的线性关系，y=1.22379+0.02268x，相关系数R=0.99886，决定系数R2=0.99772（图5）。根据标准曲线计算得藤茶供试样本中的二氢杨梅素含量如表1所示，可以看出内生真菌处理均能不同程度地降低藤茶中二氢杨梅素的积累，高浓度处理组的抑制作用有统计学意义（P＜ 0.05），而低浓度处理组的抑制作用没有显著性差异（P＞ 0.05），其中高浓度内生真菌灭活液根际灌施对二氢杨梅素积累的抑制作用最强（表1）。

图5 二氢杨梅素的标准曲线Figure 5 Standard curve of dihydromyricetin

表1 LZC-2处理对藤茶中二氢杨梅素含量的影响Table 1 Effect of LZC-2 treatment on dihydromyricetin content in vine tea

2.3 内生真菌对藤茶杨梅素含量的影响

杨梅素浓度在1.2 ～ 9.6 mg/L，浓度与吸光值间有良好的线性关系，y=0.1084+0.03643x，相关系数R=0.99958，决定系数R2=0.99917（图6）。

图6 杨梅素的标准曲线Figure 6 Standard curve of myricetin

根据标准曲线计算得藤茶供试样本中的杨梅素含量如表2所示，可以看出各处理藤茶中的杨梅素含量变化区间为17.86 ～ 23.13 mg/g，其中高浓度内生真菌孢子悬液和其灭活液根际灌施均能显著增加藤茶中杨梅素的积累（P＜0.05），而其它内生真菌处理对杨梅素含量的影响没有统计学意义（P＞ 0.05）（表2）。

表2 LZC-2处理对藤茶中杨梅素含量的影响Table 2 Effect of LZC-2 treatment on myricetin content in vine tea

3 讨论

藤茶幼嫩茎叶中二氢杨梅素含量较高，被誉为黄酮类化合物在植物体中分布的一种特例[4]。然而藤茶植株中大量光合产物流向二氢杨梅素的机制尚不清楚。植物次生代谢产物种类多，具有广泛的药用价值，其合成和积累不仅受遗传基因的控制，还受到生长发育阶段、季节和环境因子（光照强度、光质、温度、水分和养分）等多种因素的影响[5]。内生真菌广泛存在于植物的健康组织内，在长期的进化过程中与其宿主植物建立了特殊的关系，这种关系显著影响植物次生代谢产物的合成和积累。

大量报道显示，内生真菌可以促进宿主植物次生代谢产物的积累，如内生曲霉（Aspergillus sp）可提高宿主植物毛脉酸模山楂素、白藜芦醇、大黄酚和大黄素的含量[6]。本试验研究发现内生真菌LZC-2处理降低宿主植物二氢杨梅素的积累（表1），而高浓度内生真菌LZC-2根际灌施显著增加宿主中杨梅素的积累（表2）。这些现象暗示不是所有内生真菌都能促进植物活性次生代谢产物的合成和积累，内生真菌抑制部分次生代谢产物的积累也可能利于其他次生代谢产物的合成和积累，甚至改变植物次生代谢产物的组成。类似的情况在内生真菌对薄荷（Mentha piperitaL.）[7]以及高羊茅（Festuca arundinacea schreb）[8]的次生代谢物积累影响的试验研究中均有报道。

值得注意的是，高浓度内生真菌LZC-2孢子悬液灭活液根际灌施既能显著降低藤茶植株二氢杨梅素的积累，也能提高杨梅素的积累，表明内生真菌LZC-2很可能是通过其诱导子调控藤茶植株次生代谢产物二氢杨梅素和杨梅素积累的。迄今利用真菌诱导子调控药用植物次生代谢产物的合成和积累已有大量报道[9]，诱导子信号被传递到细胞内以后，通过控制次生代谢途径中关键酶的基因表达来调控次生代谢产物的生物合成[10]。内生真菌LZC-2对宿主藤茶二氢杨梅素和杨梅素积累的调控作用是否是通过控制其代谢途径中关键酶的基因表达来实现，尚需要进一步的试验研究。