HPV52 E6和E7基因多态性与宫颈上皮内瘤变相关性

王巧祎,赵希芹,郭雨辰,张璐,李晓欣,王云

(青岛大学,山东 青岛 266071 1 基础医学院病原生物学系； 2 附属医院检验科； 3 基础医学院2018级临床医学专业)

宫颈癌是严重威胁女性生命的恶性肿瘤之一，2020年研究数据显示，宫颈癌的发病率和病死率在全球女性恶性肿瘤中位居第4位[1]。宫颈上皮内瘤变(CIN)是反映宫颈癌持续发展的重要指标，而持续人乳头瘤病毒(HPV)感染是导致CIN和宫颈癌发生发展的关键因素[2]。HPV有200余种基因型，不同地区及不同宫颈疾病人群中HPV的感染率和基因型分布均存在差异。以往的个例报道和Meta分析数据均表明，在我国HPV 52型(HPV52)是与宫颈病变发生有关的一种重要的HPV基因型[3-6]。HPV编码基因存在多态性，E6和E7是HPV致癌的关键蛋白，其多态性与宫颈病变发生的相关性备受关注。但目前对HPV52E6和E7基因多态性的研究相对较少，其与宫颈病变的关系尚无明确结论[7-12]。本研究分析比较青岛地区正常和不同级别CIN样本中HPV52E6和E7基因多态性，为丰富HPV52分子流行病学资料和明确HPV52基因变异在宫颈病变中的作用提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2019年6月—2020年12月于青岛大学附属医院中心实验室行HPV基因型检测并进行阴道镜下宫颈活检的门诊、住院病人及体检女性为研究对象。首先采集宫颈脱落细胞样本，采用HPV分型检测试剂盒(亚能生物技术深圳有限公司)进行HPV检测，样本采集和检测步骤均严格按照试剂盒说明书的要求操作，并留取HPV52单独阳性标本-20 ℃冻存。然后利用病人门诊号(唯一号)通过医院医渡云科研平台检索留取样本病例的病理检测结果，选取其中首次进行宫颈活检的病例，并进一步检索或咨询其年龄、户籍和民族等相关信息。最后纳入177例样本进行HPV52E6和E7基因序列检测和分析，其中病理结果显示正常者68例，CIN1者57例，CIN2/3者52例；病人年龄21～77岁，平均(43.02±11.40)岁；病人均为青岛地区户籍，汉族，有性生活史，无子宫切除、宫颈手术及HPV感染治疗史。177例样本经序列检测后共138例样本成功获得E6和E7基因序列，其中病理结果正常者47例，CIN1者46例，CIN2/3者45例。正常组年龄为22～77岁，平均(44.45±12.10)岁；CIN1组年龄21～67岁，平均(43.44±12.36)岁；CIN2/3组年龄21～65岁，平均(40.91±10.53)岁，3组之间年龄差异无统计学意义(F=1.100，P=0.336)。

1.2 E6和E7基因序列检测

采用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在线设计引物，扩增区域包括E6编码区(nt 102～548)和E7编码区(nt 553～852)。引物名称、序列、扩增片段大小及其在基因组中的位置见表1。先以HPV52-F1和HPV52-R1为引物进行PCR扩增，出现扩增条带的直接测序；如果没有出现扩增条带，则以该扩增产物为模板进行第2轮扩增，扩增引物为HPV52-F2和HPV52-R2，出现扩增条带者进行测序。PCR扩增反应体系内含有：Taq Green PCR Master Mix(美国赛默飞世尔科技公司)15.0 μL，上下游引物各1.2 μL，DNA模板2.0 μL，用水补足至30.0 μL。循环条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。取3 μL的PCR产物进行20 g/L琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。每次PCR反应均设阴性对照和阳性对照，阴性对照为HPV阴性的宫颈癌细胞系C-33A提取的DNA，阳性对照为已知HPV52阳性标本DNA。

取上述PCR产物25 μL送北京华大基因有限公司测序，测序所用引物为HPV52-F2、HPV52-R2和HPV52-R3，采用末端终止法进行双向测序。以HPV52标准株X74481(GenBank收录号X74481)序列作参比，采用Lasergene软件(version 7.0)进行序列剪接和对排。

表1 HPV52 E6和E7基因变异检测所用PCR和测序引物

1.3 系统进化树分析

从GenBank中获取HPV52变异型或亚型A2、B1、B2、C1、C2和D代表株E6、E7序列，这些代表株GenBank收录号分别为HQ537739、HQ537740、HQ537743、HQ537744、HQ537746和HQ537748[7]，标准株X74481为A1变异亚型。用MEGA 7.0软件，将本研究所获得的E6和E7序列及上述代表株序列，用Clastal W方法进行比对和同源性分析，临接法(Neighbor-joining)绘制系统进化树[13]。

1.4 统计学分析

应用SAS 9.4统计软件进行数据分析。采用Fisher确切概率法比较不同组间HPV52E6和E7基因变异型的分布。以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 E6基因序列多态性

与标准株比较，138例标本中除2例在E6基因编码区未出现变异，其余标本均出现单核苷酸突变，未见插入或缺失。共出现6处错义突变和10处同义突变。错义突变中，K93R见于134例样本(4例样本核苷酸a378c和a379g突变导致氨基酸K93R突变，130例a379g突变导致K93R突变)，其中1例样本还出现K93G突变(核苷酸a378g和a379g突变)；N122K(c467a)突变见于2例样本；Q38H(a215t)、F45R(t235a)和L67V(c300g)同时出现于1例样本；W132R(t495c)见于1例样本。同义突变中，g350t见于133例样本，g356a见于15例样本，t191c和g356a突变各见于2例样本，a180c、a278t、t309c、g371a、a422g和a530g各见于1例样本。

本文138例样本共出现15条不同序列，将这15条不同基因序列与GenBank中A1、A2、B1、B2、C1、C2和D代表序列共同绘制系统进化树(图1)，结果显示，2例样本序列属于A1变异亚型，与代表株X74481-A1序列相同；3例样本序列属于A2变异亚型，与代表株HQ537739-A2比较，均出现错义突变K93R，但是未出现同义突变a251g；132例样本序列属于B变异型，与代表株HQ537740-B1和HQ537743-B2的序列相同，均同时出现错义突变K93R(1例为K93G)和同义突变g350t；1例样本序列属于C2变异亚型，与代表株HQ537746-C2比较，出现同义突变a530g，但在氨基酸83仅出现核苷酸g350t突变，而代表株同时出现核苷酸g350t和c348g突变导致氨基酸L83V突变。

正常、CIN1和CIN2/3组E6基因各变异型分布差异无统计学意义(P=0.741)，3组均以B变异型为主。见表2。

2.2 E7基因序列多态性

与标准株比较，138例标本中除2例标本在E7基因编码区未出现变异，其余标本均出现单核苷酸突变，未见插入或缺失。共出现12处错义突变和7处同义突变。在错义突变中，M1T(t554c)和Y11C(a584g)同时出现于1例样本；T37I(c662t)、S52D(a706g、g707a)、Y59D(a728g)、H61Y(c733t)、D64N(g742a)和L99R(t848g)同时见于1例样本，其中D64N还见于另外2例样本；M84I(g804t)见于1例样本。在同义突变中，a801g出现于136例样本，c751t出现于133例样本，t583g、a681g、t765c、a793t和c837g各见于1例样本。

本文138例样本共出现12条不同序列，将这12条不同基因序列与GenBank中A1、A2、B1、B2、C1、C2和D代表序列共同绘制系统进化树(图2)，结果显示，2例样本序列与代表株X74481-A1和HQ537739-A2序列均相同，在系统树中属于A变异型，这2条序列与E6基因属于A1变异亚型的2条序列来源于相同样本；135例样本序列与代表株HQ537740-B1和HQ537743-B2比较，均同时出现同义突变c751t和a801g，属于B变异型；1例样本序列属于C变异型，其与E6基因属于C变异型的序列来源于同一样本，该序列与HQ537746-C2的序列相同，出现6处错义突变(T37I、S52D、Y59D、H61Y、D64N和L99R)和2处同义突变(t583g和a801g)。除3例在E6区属于A2变异亚型的序列在E7区属于B变异型外，其余序列在E6和E7区的变异型分类一致。

正常、CIN1和CIN2/3组中E7基因各变异型分布差异无统计学意义(P=0.472)，3组均以B变异型为主。见表3。

图中X74481-A1、HQ537739-A2、HQ537740-B1、HQ537743-B2、HQ537744-C1、HQ537746-C2和HQ537748-D为代表株，标本名称以阿拉伯数字表示，标本名称后括号中数字表示与该标本序列相同的标本数量。

表2 HPV52 E6变异型在正常、CIN1和CIN2/3组中的分布(例(χ%))

图中X74481-A1、HQ537739-A2、HQ537740-B1、HQ537743-B2、HQ537744-C1、HQ537746-C2和HQ537748-D为代表株，标本名称以阿拉伯数字表示，标本名称后括号中数字表示与该标本序列相同的标本数量。

表3 HPV52 E7变异型在正常、CIN1和CIN2/3组中的分布(例(χ%))

3 讨 论

HPV52编码基因具有多态性，根据其编码的E6、E7、主要衣壳蛋白L1和长控制区(LCR)基因多态性，将HPV52分为A、B、C、D等4种基因变异型，进一步分为A1、A2、B1、B2、C1、C2和D等7种变异亚型[7]。以往研究显示，HPV52变异型的分布具有地域差异，亚洲以B变异型为主，欧洲、美洲和非洲均以A变异型为主，C和D变异型在各地域检出率均较低[8-9,14-21]。本研究首次对来自青岛地区正常和CIN样本中HPV52E6和E7基因进行检测，结果显示本地区样本E6和E7基因均以B变异型为主，分别占95.7%和97.8%。这与日本、我国四川、上海和北京等地的检测结果相似，2篇来自日本的研究中B变异型检出率分别为96.2%(50/52)和92.3%(36/39)，四川为97.6%(41/42)，上海为96.3%(52/54)，北京为90.0%(45/50)[9,14-17]。但本研究样本中HPV52E6和E7变异型的分布与台湾和湖北荆州的检测数据存在明显差异，台湾280例样本中A、B和C变异型的检出率分别为0.7%、88.2%和11.1%，湖北荆州168例样本中B、C和D变异型的检出率分别为85%、5%和10%[18-19]，这两个地区B变异型的检出率相对较低，C或者D变异型的检出率相对较高。上述各地区HPV52 B变异型的检出率均高于越南(73.7%，28/38)和菲律宾(62.5%，20/32)[9]。可见亚洲不同地域或国内不同地域HPV52E6和E7基因变异型的分布存在差异，对不同地域样本的检测可为全面了解HPV52的分子流行病学特征提供有价值的信息。

HPV基因变异与宫颈病变的关系是HPV致癌机制研究的热点问题之一。有研究比较同一地区不同程度宫颈病变或细胞学异常人群与正常人群中HPV52E6和(或)E7基因变异情况，结果显示不同宫颈病变人群及正常人群之间基因变异型或基因突变分布无明显差异，从而认为HPV52E6和E7基因变异与宫颈病变发病风险或病变严重程度不相关[9,22-23]。本研究结果显示，HPV52E6和E7基因变异型分布在正常、CIN1和CIN2/3组中差异无显著性，且多数样本序列相同，提示HPV52E6和E7基因多态性与CIN发生发展无明显相关性。但也有研究结果显示，HPV52E6和E7基因某变异型或特定突变增加了CIN或宫颈癌患病风险，如韩国的一项研究中，HPV52E6基因以B变异型和C变异型为主，而且B变异型E6基因的K93R(A379G)突变与宫颈恶性病变相关[10]；加拿大的一项研究亦表明，LCR的t7744c和E6的K93R突变增加了CIN2/3(与CIN1+正常比较)的发生风险[24]；台湾一项研究显示，E6和E7的C变异型增加了高级别鳞状细胞内病变及宫颈癌的发生风险[18]；美国最新的一项病例对照研究采用全基因组测序检测50例CIN3和39例正常女性宫颈样本，发现C2变异亚型与CIN3高风险有关[21]；ZHANG等[8]的研究显示，与A型比较，B型和C型增加了CIN3及宫颈癌的发生风险。与HPV52E6和E7变异增加患病风险不同，江苏地区的一项研究和广州地区的一项研究分别显示，宫颈病变(CIN1/2/3和宫颈癌合并)样本HPV52E6基因的突变频率显著低于正常样本，从而认为E6基因突变可能阻碍宫颈病变和宫颈癌的发生发展或降低HPV的致癌作用[11-12]。由此可见，HPV52E6和E7基因多态性与宫颈病变的相关性目前尚不能得出明确结论。导致不同研究结论不一致的原因，可能与研究样本例数偏少、纳入研究病种不一致、疾病分组不一致和地域局限等有关。

总之，本研究表明，来自青岛地区宫颈细胞样本中HPV52E6和E7基因主要为B变异型，且E6和E7基因多态性可能与CIN发生发展无明显相关性。本研究结果为了解该地区HPV52分子流行病学特征以及进一步明确HPV52基因变异与宫颈病变的关系提供了数据支持。