采用更精准、非靶向鉴别手段，保证食品真实性
——探索高通量基因测序技术未来发展之路

□ 文 张聪

3月15日晚，央视“3·15晚会”曝光了一系列问题食品，其中包含5家食品企业用低价木薯粉和玉米粉混制冒称“红薯粉条”“山药粉条”等造假掺伪乱象。最终，当地监管部门依法查封涉事生产经营场所，查扣涉事原料及产品，责令停止生产经营活动，企业负责人全部被公安机关带走调查，并出台了相应的整治工作方案。此次事件，使“食品真实性”问题再一次被推上风口浪尖。

什么是食品真实性？

提到食品真实性，也许很多人会感到一头雾水，近年来在国际社会上广受关注的热门名词“食品真实性”到底是什么?

事实上，食品真实性和食品安全、食品质量并列，是食品的三大属性之一。与食品安全性相比，近年来食品真实性问题引发的事件在国内外也造成了一定的轰动：2013年爱尔兰食品安全局揭露的非法“马肉掺假”丑闻，几乎牵涉到欧洲所有的国家；再如，受利益驱动，香米中掺杂更便宜的品种、将猪肉上色当作牛肉售卖、选购烟台苹果但其实际产地并非烟台、蜂蜜中添加果葡糖浆……食品造假事件在人们的生活中屡见不鲜，生产以次充好的产品，标示虚假的产地、生产厂名、厂址等，均属于食品真实性问题。

食品真实性鉴定技术发展的时代背景

随着食品造假技术的演变，采用常规手段越来越难以检测食品的真实性，导致其成为全球共治的监管难题，亟须更有针对性的精准鉴别手段。自2013年欧盟爆发“马肉风波”以来，欧盟将食品真实性技术研究列入Horizon2020项目重点研究领域；2014年，食品科学界将食品真实性单独列出，与食品安全和食品质量并驾齐驱，成为消费者关注的热点。在我国，政府也高度重视真实性鉴定问题—2017年，科技部正式发布《“十三五”食品科技创新专项规划》，首次明确提出了“食品反掺假控制技术”专项研究项目，支持食品真实性技术的发展。

庞大的检测需求极大地催生了食品真实性鉴定技术的发展，一些对于鉴定结果要求较高的机构也开始运用高通量基因测序技术在该领域进行试水。那么，与其他鉴定方法相比，高通量基因测序技术有着怎样的优缺点？国内使用这一技术进行食品真实性鉴定的水平如何？发展前景又是怎样的呢？带着这些问题，《食品安全导刊》杂志特设“高通量基因测序技术用于食品真实性鉴定”专题，邀请中国农科院质标所畜产品质量安全研究室主任陈爱亮、广西壮族自治区食品药品检验所微生物室副主任甘永琦、国家蛋白质科学基础设施（北京）北大分中心蛋白质核心支撑平台技术主管李桂澜、SGS中国区健康食品行业负责人杨潞芳博士这4位专家，以及华大智造中国区市场部总监雷莹共同探讨食品真实性鉴定的相关问题及高通量基因测序技术的发展。

食品真实性现状及不同的检测技术

我国当前的食品质量安全状况逐步好转，但总体形势依然严峻，食品造假掺伪等情况时有发生。陈爱亮表示，食品掺假是基于经济利益驱动的用低值食品成分冒充高值食品成分的行为，因此一般相对价值较高的食物更容易被掺假，如用鸭肉冒充羊肉。实际上，食品掺假现已广泛发生在各种动植物食品中，除了上述的鸭肉冒充羊肉，还有猪血冒充鸭血、牛奶冒充羊奶、普通奶冒充A2奶、油鱼冒充鳕鱼、意蜂蜜冒充土蜂蜜、玉米油冒充橄榄油等等，这些属于物种成分掺假；此外，还有产地来源造假，如假冒拉菲红酒、盐池滩羊肉等。这里要说明的是，食品掺假不仅仅在中国，在国外也是广受关注的食品安全问题。由于食品掺假的查处难度大，监管成本高，故已成为全球性的挑战。

那么，一般会选择采用怎样的检验方法对掺假食品进行辨别？陈爱亮老师也给出了答案。“针对不同的掺假形式，需要用到不同的检验方法。目前来说，用于食品掺假的鉴定方法主要有4类，一是色/质谱、核磁方法，主要通过分析食物代谢物的组成成分进行食品真实性鉴定；二是DNA分析法，即通过测定食物DNA对食品物种来源进行鉴定；三是元素分析法，通过测定食品中稳定同位素及矿物元素比值，对食品的产地来源进行鉴定；除此以外还有红外光谱等技术。”陈爱亮继续说道，“其中，DNA分析法中又包括荧光定量PCR法、DNA条形码和高通量测序方法等，且DNA条形码和高通量测序会用到基因测序仪。实际上，DNA分析法是目前公认的食品掺假物种鉴定最稳定和可靠的方法之一。”

在食品真实性鉴别方面，高通量测序技术虽然已经得到了部分应用，但由于该技术数据量大，结果分析要求高，缺乏相关的高通量测序分析方法标准，因此在国际上并未大规模普及。据了解，与国际相比，国内高通量测序技术在食品真实性鉴定方面的应用报道较少，且大多处于研究起步阶段，尚未在企业质检中心等广泛推广普及。从检索相关文献资料的情况来看，近年来，我国相关数据库中“高通量基因测序技术在食品检测中的应用”名录下已有千余篇文献研究，表明该领域的研究已有一定基础，还有较大的发展空间。

高通量基因测序技术的优势所在

高通量基因测序技术是一次能对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定的技术，其经过将待测的目标DNA片段化、加接头，制备测序文库，通过对文库中DNA片段进行大规模平行测序，检测对应的信号，最终获取序列信息。因此，即使食品掺假的手段再“高明”，也难逃它的“法眼”。

例如，蜂产品掺假包括完全用糖浆和香精勾兑的人造蜂蜜、在天然蜂蜜中加入果葡糖浆等各种糖浆等的混掺蜂蜜，以及直接喂食蜜蜂糖水的劣质蜂蜜；除此之外，还有蜜源造假，即用杂花蜜冒充单一花品种蜜，用意蜂蜜冒充中蜂蜜等。“对于蜜源造假，一般可以通过检测蜜源植物或蜜蜂物种特异性的DNA进行鉴定。由于蜂蜜中的植物来源可能存在多种且未知的情况，利用高通量测序技术可以实现样品中各种物种源性成分的快速鉴定，与传统的PCR鉴定方法相比，具有非靶向、高通量及定量分析的优势。”陈爱亮解释说：“其实高通量测序技术最大的优势之一就是对于混合生物制品中的所有物种成分进行全景扫描，同时给出各物种成分的含量，因此对于食品企业复杂食品原料质控具有重要的意义。比如出口阿拉伯食品企业、中成药企业等对复杂原料物种成分的鉴定，利用高通量测序技术可以提高鉴定的准确率和效率。”

再如，肉类加工食品在生产过程中原料需经绞碎等处理，配以辅料与添加剂，通过熏、煮或炸等特殊工序而具有良好的外观和风味。由于消费者难以通过感官分辨产品中的肉类与配料表是否一致，所以部分商家为了降低成本，会在产品中有目的地替代或添加价格低廉的肉类。对此，甘永琦说道：“由于常规检测方法每次只能确定或排除一种已知的动物源成分，无法适用混合肉制品的组成比例分析及未知掺假肉类的鉴定，与掺假手段的隐蔽性和复杂性相比具有严重的滞后性，难以满足对肉制品掺假造假检测的需要。因此，在食品真实性鉴定方面，肉类加工食品也会较多地应用到高通量测序技术。”对此，甘永琦也提出了他的解决方法—将DNA条形码和高通量测序技术相结合，创新研发出DNA宏条形码技术，其在分析食品中动物源性成分具有多方面优势：一是对生物混合体系具有强大的分析能力，可同时检测标识成分、混伪品、有毒动物或受保护动物的成分，以及在生产过程中引入的其他动物杂质，从而保证肉制品的有效性、安全性与合法性；二是对于物种的鉴别具有唯一性，可以从基因角度对不同物种进行分析并能准确将其界定；三是可进行生物混合体系中各物种成分的相对定量分析，通过测序将所有物种的序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units），利用生物信息软件与数据库进行比对分析。

政策支持和市场机遇为发展赋能

利用高通量测序技术进行食品真实性鉴定是该技术近年来发展的新领域，在国内，SGS于2017年底便开始为企业提供动物性食品、植物性食品及鱼类产品的二代测序服务。欧美等国也已通过高通量测序技术实现了对肉品DNA混合物的物种成分分析、蜂蜜的真伪鉴别等。此外，高通量测序技术在深加工食品的鉴定中也得到了很好的应用，实现了对糖果中物种成分的鉴别。目前，这一技术的研究重点为围绕数据库比对、阈值设定、生物信息学分析等方面提高物种鉴定的效率和准确性。

国际标准化工作方面，2021年10月，国际标准化组织发布ISO 22949-1-2021，规定了食品和饲料产品中动物物种检测和鉴定中DNA测序方法性能的一般要求。杨潞芳介绍道，“经专家多年研讨，ISO 22949-1-2021形成了测序方法的整体框架和通用要求，包括引物设计、数据库构建、方法评价、实验室测试等各个环节，从样品制备到核酸提取，再到一代/二代测序的流程，直至测序结果表述，总体来说是一项流程完整的通用测序规定。虽然高通量基因测序技术已经在生物、医学、大健康等领域有了较为成熟的应用，但在食品领域的发展尚属起步阶段。可以预见的是，作为食品与饲料领域有关DNA测序方法的首个ISO标准，这一标准的出台将为该技术在食品和饲料领域特别是食品真实性鉴定方面的广泛应用铺平道路。”

在我国，国家层面出台的各项相关政策也正在持续发力。杨潞芳表示，《“十四五”市场监管科技发展规划》中提出，在食品真实性鉴别及溯源技术研究方面，要研究食品中未知掺假物的非靶向筛查、精准定量、产地溯源、身份标识及品质识别技术，建立完善经济利益驱动掺假（EMA）数据库，构建全链条智能追溯系统，来解决食品真实性原料质量管控和溯源瓶颈问题。她说道：“在特殊食品及新技术食品安全监管关键技术研究中，同样也提到要对未知与非食用物质风险高通量筛选和评价，这无疑是享有高通量、非靶向及定量分析优势的高通量基因测序技术发展的一个契机。要想实现以上目标，需要多学科领域人才的协同创新，如食品学科、化学学科、分子生物学科、生物信息学科等，进而整合各方资源实现行业长足发展。而该目标的实现对于某个企业或机构来说难度不言而喻，所以将其作为国家政策对该技术进行指引和号召，将更强有力地推动我国高通量基因测序技术在食品真实性鉴别方面的发展。”

事实上，在使用高通量测序技术进行食品真实性鉴定时，几位专家也在实际操作中遇到了一些痛点问题。

第一，无具体的国标方法可以参考。据李桂澜介绍，在使用该技术进行食品真实性鉴定方面，因国家并未出台具体的国标方法，国内外研究学者们通过在实际操作中不断的探索，最终形成了几种较为一致的检测准确度的鉴定方法，如使用16s和12s核糖体RNA的高通量测序分析以及DNA条形码技术进行肉类的掺假检测。

第二，对测序产生的海量数据分析能力要求高。高通量测序技术具有高通量、非靶向和定量分析的优势，可以对食物样品中的所有潜在物种源性成分一次性全部鉴定出来，并给出相对含量。但也正是由于高通量测序能够生成大量的基因测序数据，因此对测序大数据的分析技术要求非常高，除了高通量测序数据的常规分析外，对于物种鉴定，还涉及比对数据库的权威性、物种认定的同源性阈值设定、测序reads数的百分比阈值设定等多个方面，需要根据不同的食物类型进行实验研究来最终确定。

第三，高通量测序仪器及配套耗材价格昂贵。与其他鉴定技术相比，高通量测序试剂总体来说成本较为昂贵，因此从仪器、试剂盒等配套乃至整个供应链的国产化比率提高都显得尤为重要。

针对上述挑战，亟需从以下几个方面着手进行解决。首先，应该筛选稳定可靠的各种食物物种核心DNA条形码及辅助条形码序列，建立权威可靠的物种DNA条形码数据库；其次，针对不同类型食物物种成分，开展模拟掺假鉴定研究，开发物种鉴定分析软件，制定合理的同源性比对阈值以及掺假定量分析阈值，提高物种鉴定的准确率；最后则是围绕食品真实性鉴定制定相关的国家标准，包括DNA条形码数据库标准、高通量基因测序方法标准以及数据处理等规范等。同时，还应加速基因测序硬件国产化。测序仪在整个产业链中拥有极高的技术壁垒和应用价值，为中下游测序服务提供技术和工具的支撑，测序仪的国产化可以打破竞争壁垒，快速促进行业的发展。

国产仪器品牌华大智造的崛起之路

高通量测序仪是基因测序“皇冠上的明珠”，从测序技术研发、验证到测序仪器的生产制造是一个系统工程，因此测序仪器的性能受到多种因素影响。谈及仪器品牌选择的问题，几位专家均较为看好国产品牌的发展。李桂澜认为，就整体情况而言，国产仪器品牌基本上可以满足其日常的测序需求，并已在实践中得到验证，希望国产品牌商可以朝着提升用户服务与体验的方向发展。陈爱亮提出，原本市场上的高通量基因测序仪是以进口品牌为主，但近几年以华大智造为代表的国产品牌也逐渐发展成熟起来且性能越来越稳定好用，还具有价格优势，所以比较看好国产测序仪的发展。甘永琦表示，如果国产仪器的性能可以与进口比肩，则更倾向于国产仪器，原因是国产仪器性价比高，实验成本更低。

据悉，在国产测序仪器品牌中，华大智造已基本实现对进口产品的同步与超越。华大智造总部位于中国深圳，业务布局遍布六大洲80多个国家和地区，已在全球多个国家和地区设立科研、生产基地及培训与售后服务中心，累计服务超过 1 300家用户，是全球少数几家具有自主研发并量产临床级高通量基因测序仪能力的企业之一。

为了深入了解国产仪器的发展情况，本刊也邀请到华大智造中国区市场部总监雷莹参与本话题，她表示，就技术本身而言，有别于其他技术路线的PCR指数扩增，华大智造独有的DNBSEQ测序技术采用RCA滚环扩增，每次扩增错误不会累积，具有更高的准确性和更低的标签跳跃率。同时，规则阵列芯片技术能够提供更高的信号密度，更低的重复序列率，大幅提高检测的准确性。另一方面，华大智造已经具备量产临床级高通量基因测序仪的能力，这为充分发挥DNBSEQ测序技术的优势提供了保障。

如今，华大智造推出不同数据通量、测序读长的测序仪器 型号，包 括DNBSEQ-E、MGISEQ-200、MGISEQ-2000、DNBSEQ-T7及DNBSEQ-Tx系列高通量测序仪，覆盖SE50-SE400、PE100-PE300等 多 种读长模式，可以实现从微生物基因组到动植物基因组的全场景测序应用，这为高通量测序技术在食品真实性应用方向的全链条国产化奠定了良好基础。特别是SE400读长的测序模式，非常适合高通量宏条形码测序，已成功支持了多项宏条形码测序的研究。“同时，为了降低设备使用门槛及提升易用性，华大智造还配套研发了自动化样本制备系统和数据分析工具，实现样本处理、基因测序、数据分析的全流程便捷高效。后续，面对目前实际操作中遇到的痛点问题，华大智造希望与行业各方一道，共同建立可靠的物种DNA条形码数据库、开发配套的物种鉴定分析工具、推进相关国家标准及技术规范的制定。最后，我们企业自身还将继续突破与超越，持续推出性能更优、操作更便捷、满足不同应用场景的国产测序仪器。”雷莹如是说道。

未来发展前景展望

通过与几位专家进行的深入交流采访，可以看出高通量测序技术在进行食品真实性鉴定领域已占有一席之地。高通量测序技术凭借其高通量、非靶向以及定量分析等其他技术无可比拟的优点，在食品真实性鉴别领域正在得到越来越广泛的应用。

随着食品真实性鉴定的需求越来越多，高通量测序技术操作进一步简化，生物信息学分析进一步自动化等，作为食品真伪鉴别的终极武器，相信在未来基于高通量测序的检测方法将在食品真实性鉴定领域具有更大的发展空间，或将成为食品真伪鉴别中不可或缺的重要技术之一，为食品安全监管及执法机构提供有效的技术支撑。