洋红风铃木种子不定芽诱导研究

何 冰，潘浩汉，吴建阳，罗 威，武爱龙*

（1.湛江幼儿师范专科学校，广东湛江 524037；2.岭南师范学院基础教育学院，广东湛江 524037）

洋红风铃木（Tabebuia rosea），又称为巴拉圭风铃木等，为紫葳科风铃木属植物，广泛分布于墨西哥、巴西、巴拉圭、玻利维亚等美洲地区。其花冠呈漏斗状，又似风铃状，开花季节花团锦簇，色彩鲜艳，具有独特风韵以及优良的景观效果[1-2]。目前，由于风铃木作为国内刚引进的园林树种，研究比较少，其中针对黄花风铃木的研究又占到很大部分[3-6]，对于洋红风铃木的研究非常少，都是和其他风铃木品种一起从种质资源形态与分子鉴定[7]、开花性状与观赏价值[8]、开发利用前景[9]、品种生长适应性[10]等方面研究，国内外还没有单独对其进行研究。目前洋红风铃木已在华南地区广泛种植，主要用于行道树、庭院树以及生态景观林带营建。该研究以洋红风铃木种子为外植体，研究不同激素浓度（6-BA、IBA、NAA、IAA、GA3）对洋红风铃木初始培养、芽的分化影响，并基于单因素的预试验基础上，建立洋红风铃木植株的不定芽诱导体系，并利用单因素法、响应面法对其诱导出芽的情况进行优化，以期为洋红风铃木的种苗繁殖提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料。供试洋红风铃木种子于2019年2月采自于岭南师范学院树人广场，其位于广东省粤西地区，属于热带亚热带气候，并受海洋气候调节，全年气候整体良好。采集方式待荚果成熟，呈黑褐色，未开裂之前采集种子。

1.1.2 外植体灭菌。在超净工作台上，先用75%的酒精擦拭消毒洋红风铃木荚果外壳，随后剥去荚果外层，取出其种子，再用75%的酒精消毒浸泡1 min，用无菌水冲洗3次，然后再放入0.2%的升汞（加几滴吐温-20）中浸泡消毒1 min，其间不断摇动，倒掉升汞溶液后，用无菌水冲洗6次备用。

1.2 方法

1.2.1 接种。将消毒洗净后的洋红风铃木种子放在无菌超净台上30 min，等种子表面水分晾干后，将其接种到初始培养基中。

1.2.2 初始培养基的筛选。①单因素试验设计，选用MS作为基本培养基，将6-BA、GA3分别设置5个浓度梯度：6-BA（0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L）；GA3（0、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/L）。将种子分别接种到初始培养基内，每瓶接种1粒种子，每个处理接种30瓶，3次重复，30 d后，统计各处理的出芽情况。②响应面（RSM）试验设计，在单因素预试验基础上，得到初始培养2种激素6-BA、GA3有效的浓度范围，根据响应面法设计原理，以发芽率为响应值，确定初始培养中激素组合的最佳配比，共13个处理（表1）。将洋红风铃木种子接种到不同初始培养基中进行种子发芽处理，每瓶接种1粒种子，每个处理接种30瓶，3次重复，30 d后，统计各处理的发芽情况，进而探讨最佳初始培养基。

表1 洋红风铃木初始培养基试验设计

1.3 数据统计与分析

利用Design Expert 8.0.6软件对所得数据进行分析，推测出最佳组合配方并进行实际试验验证。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

将消毒后的种子接种到初始培养基中，30 d后观察发芽情况（表2）。培养中发现，洋红风铃木种子在有激素添加的情况下，出芽率明显提高。不同的初始培养基由于添加的激素种类以及浓度不一致，其出芽率也有很大差异，其中在添加6-BA的激素中，出芽率最高的是A3处理，出芽率均值达到59.85%，芽的长势较好。随着6-BA激素浓度达到0.8 mg/L时，出芽率反而降低，芽苗出现玻璃化、纤细现象；在添加GA3的激素中，出芽率均值最高的是B2处理。随着GA3激素浓度达到0.4 mg/L时其出芽率反而降低，畸形芽变多。综上，洋红风铃木种子出芽处理中，添加6-BA激素的处理要略高于添加GA3激素的处理，同时初始培养基激素添加范围建议6-BA为0.2～0.6 mg/L，GA3为0～0.2 mg/L。

表2 单因素试验结果

2.2 激素组合对洋红风铃木出芽率的影响

在无菌超净台上将消毒灭菌后的种子接种到初始培养基中，30 d开始统计不定芽的出芽率。从表3可以看出，13组组合都可发芽，不同组合的出芽率存在较大差异，出芽率的范围在34.31%～91.83%，其中第4组组合出芽率最高，第9组组合出芽率最低。

表3 洋红风铃木出芽率响应面试验设计与结果

2.3 出芽率回归方程分析

以培养基中6-BA（A）、GA3（B）为自变量因素，洋红风铃木种子播种出芽的出芽率（Y）为响应值，根据试验结果（表4）得到回归方程为：Y=78.48-19.40×A-4.26×B-4.30A×B-8.36A2-9.78B2，该回归方程有极显著性（P＜0.000 1）；方程失拟不显著（F=1.95，P＞0.1），由此可以看出，该回归方程拟合性好，可以用于洋红风铃木种子出芽率的理论预测。模型的变异系数为4.28%（＜10%），表明模型试验良好，稳定性不错。从表4可以看出，A、B、A2达到差异极显著（P＜0.01），AB达到差异显著（P＜0.05）。表明激素6-BA浓度、GA3浓度对洋红风铃木出芽率着极显著影响，6-BA浓度与GA3浓度的交互作用对结果差异不显著。通过回归方程得到最优出芽的培养基的6-BA、GA3浓度分别为：A=0.4 mg/L，B=0.1 mg/L。

表4 响应面回归方程分析

2.4 响应值和等高线分析

从图1可以看出，6-BA以及GA3交互作用显著，其中，6-BA浓度对出芽率的影响最大。因此，可知洋红风铃木种子对于初始培养基中6-BA激素浓度的变化很敏感。

图1 6-BA、GA3浓度对洋红风铃木出芽率影响的响应面和等高线

2.5 最佳激素浓度配比及验证

通过二次回归方程的分析可得出洋红风铃木诱导培养基的最优条件为：A=0.4 mg/L，B=0.1 mg/L，最佳出芽率预测值为88.48%。根据回归方程推测出的最佳激素配比MS+0.4 mg/L 6-BA+0.1 mg/L GA3，并在此条件下，进行验证，重复3次，实测发芽率为87.68%、89.12%和88.82%，平均发芽率为88.54%。试验发芽率测定值与理论预测值的误差为1%（＜5%），因此，应用响应面设计优化测定条件是可行的。

3 讨论

响应面分析法是一种可以减少试验次数、使用方便、回归预测性好的优化分析方法。在植物组培试验中，最常用的试验方法是正交试验设计，但是正交试验方法只是对一个个孤立的试验进行分析，无法找到各个因素与响应值之间的关系。牟会荣、蔡厚道等[17-18]利用以上2种试验设计方法进行试验设计与研究，均发现响应面法优于正交法。关于洋红风铃木植株再生体系的建立与优化的研究还未见报道，由于再生体系流程要经过诱导、增殖、生根的阶段，要统计出芽率、增殖率、生根率，通过传统的方法筛选最佳培养基非常不容易，要经过大量的试验，而通过利用响应面法来优化组织培养的条件，能够迅速地达到组培苗木工厂化生产的目的，并且在已有植物组织培养研究中广泛应用[11-12]。

该研究从洋红风铃木种子消毒灭菌处理、不定芽的分化，建立了洋红风铃木不定芽诱导体系，同时以洋红风铃木出芽率作为响应值，结合CCD试验设计回归分析各处理之间的总体差异，得到的试验结果再进行验证试验，可以简化组培流程，提高试验的精确度，快速进行工厂化的生产，满足市场对种苗的需求。目前国内外还没有相关报道，具有独创性的优势。因此，未来的研究可利用响应面分析法优化植物组培流程，丰富组培试验方法，促进植物组织培养研究技术的进步。