HPLC-MS/MS法测定鱼肉中19种喹诺酮类抗生素的残留研究

◎ 李盛安，何国成，陈 楠，张益文，刘正华

（1.中山市食品药品检验所，广东 中山 528437；2.中山市农产品质量安全检验所，广东 中山 528437；3.中山市三乡镇农产品质量安全检测站，广东 中山 528463；4.中山市小榄镇食品综合快检中心，广东 中山 528415）

喹诺酮类（Quinolones，QNs）抗生素长期在我国南方多个省份淡水养殖行业中使用。近30年来，随着我国淡水养殖规模的不断扩大，水产养殖周期、密度增加，由细菌、真菌引发的各种鱼类疾病频繁出现，给养殖户带来了严重的经济损失[1-2]。QNs抗生素与其他抗生素（如头孢类、四环素等）相比具有价格低廉、抗菌力强、低毒副作用和易降解等优点，加上氯霉素、红霉素等药物前后被国家相关部门禁用，使得QNs抗生素被长期广泛地应用于鱼类细菌性疾病的防治[3]。有研究表明，使用抗生素不仅可以有效抑制致病菌的生长，使得致病菌产生抗性，还会影响微生物群落多样性，对其他细菌的活性及生长产生不同程度的影响。例如，非致病菌受到不同程度抑制后，很可能影响水生动物体内及养殖水环境的微生物生态平衡，导致水环境日益恶化，引发新的疾病。水产养殖环境中残留的QNs抗生素不仅影响水生动物生长，还会随养殖尾水排放进入下游流域对水环境产生影响。

常见的检测QNs抗生素的方法有高效毛细管电泳法[4]、薄层色谱法[5]、高效液相色谱法[6]和液相色谱串联质谱法。鱼肉中含有蛋白质、脂肪等各种营养成分，多以大分子存在。采用色谱法检测抗生素残留时，由于鱼肉样品基质较为复杂，会影响色谱峰的出峰时间及峰型，从而影响抗生素残留的定性、定量，容易出现假阳性；采用LC-MS/MS检测鱼肉中QNs抗生素残留，多重反应监测模式通过采集特征离子数据，结合色谱峰保留时间进行目标化合物的定性、定量，提高了检测方法的准确性及灵敏度[7-9]。据统计， 2020年中山市水产养殖面积约为20 666 hm2，年产量约35万t，主要以淡水池塘养殖四大家鱼为主。中山市是广东省水产养殖大市，市内有多家供港澳食用农产品的生产基地，其产品在港澳市场深受市民喜爱，中山区域承担着港澳淡水鱼水产品供应的重任。因此，在中山市开展鱼肉中QNs抗生素残留检测具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

高速冷冻离心机（SIGMA公司）；匀浆机（IKA公司）；电子天平（Precisa公司）；MULTIVAPTM118 氮吹仪（Organomation公司）；XW-80A旋涡混合器（上海精科）；R-210旋转蒸发仪（BUCHI公司）；A10超纯水纯化系统（Millipore公司）；0.22 μm有机滤膜（天津津腾）；1200-G6495液相色谱串联质谱联用仪（Agilent公司）。

甲醇、甲酸均为色谱纯（Merck公司）；麻保沙星、吡哌酸、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、环丙沙星、洛美沙星、单诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星、奥索利酸、西诺沙星、氟甲喹、萘啶酸、奥比沙星、氟罗沙星和司帕沙星（德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

1.2 溶液配制

分别称取适量上述标准品，先用甲醇溶解后定容于100 mL容量瓶中，此时各组分单标储备液浓度为 1 000 mg·L-1，于4 ℃下避光保存。再将各组分单标储备液稀释后配成混合标准溶液，备用。

1.3 色谱质谱条件

（1）色谱条件。色谱柱：Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；进样量：1 μL；柱温：40 ℃；流动相：A为0.1%的甲酸水溶液，B为甲醇溶液，流速为0.4 mL·min-1；分离19种QNs抗生素的流动相梯度洗脱条件见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件表

（2）质谱条件。电离方式：ESI+；干燥气温度：350 ℃；毛细管电压：4.0 kV；干燥气流速：14 L·min-1；雾化器压力：30 psi；监测模式：多反应监测；各抗生素组分离子对及碎裂电压、碰撞能量及保留时间见表2。

表2 19种QNs抗生素测定的质谱测定条件参数表

1.4 样品处理

活鱼现宰去鳞腮，取鱼肉部分清洗干净后晾干表面水分，鱼肉搅碎后称取5 g鱼肉样品置于50 mL具塞离心管中，加入2 mL EDTA-Macllvaine缓冲溶液，涡旋混合30 s，避光放置10 min。往具塞离心管中加入20 mL 1.0%甲酸乙腈，8 000 r·min-1均质2 min，再加入10 g无水Na2SO4，离心管拧紧盖子涡旋混合 60 s，设置离心机温度为-4 ℃，以10 000 r·min-1离心3 min，将上清液倒入旋转蒸发瓶中。再往具塞离心管加入20 mL 1.0%甲酸乙腈，涡旋混合30 s，重复提取一次，将上述两次提取液合并，设置温度为50 ℃、真空度为80 kPa，调整适当转速将提取液在水浴旋转蒸发仪上浓缩至近干，用2 mL 20%甲醇溶液解残渣，再加入2 mL正己烷涡旋混合30 s，将旋转蒸发瓶中的溶液吸出置于离心管中，再在-4 ℃，以10 000 r·min-1离心3 min，吸取下清液过0.22 μm滤膜，上机待测。同时，做样品空白试验。

1.5 标准曲线绘制

使用基质配制标准溶液建立标准曲线对样品进行外标法定量，可以有效消除样品基质对抗生素组分的干扰。本文采用不含QNs抗生素的鱼肉空白基质溶液稀释配制标准品，浓度分别为1 μg·L-1、2 μg·L-1、 5 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1和200 µg·L-1的系列QNs基质配制混合标准溶液，混标溶液过 0.22 μm滤膜，上机待测。以各抗生素组分定量离子色谱峰面积为纵坐标，相应混标溶液的浓度为横坐标计算编制标准曲线。同时，做基质空白试验。

2 结果与分析

2.1 提取液的选择

考虑到鱼肉中含有大量的蛋白质及脂肪等大分子，在提取QNs抗生素时干扰物质较多。实验分别选取氧氟沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星和西诺沙星等5种具有代表性的QNs抗生素，按照本文1.4样品处理方法，在称取5 g鱼肉样品后加入上述5种QNs抗生素的混合标准溶液，添加QNs抗生素混合标准溶液后拧紧盖子后放置于4 ℃条件下过夜，各组分的浓度分别为20 ng·mg-1、50 ng·mg-1，同时进行3个样品的平行实验。对比乙腈、乙酸乙酯、1.0%甲酸甲醇和1.0%甲酸乙腈溶液4种提取液，分析上述4种提取液的加标回收率，发现1.0%甲酸乙腈溶液提取效果相对优于其他提取液。最终本文采用了1.0%甲酸乙腈溶液为提取液，结果如表3所示。

表3 不同提取液对QNs抗生素的回收率表

2.2 标准曲线及检出限

在实验方法1.5标准曲线绘制有基础上，以各抗生素组分的特征离子色谱峰3倍信噪比（S/N＞3）为方法检出限，标准曲线、相关系数R2及各组分检出限见表4。19种QNs抗生素在1～200 µg·L-1呈良好的线性关系，相关系数R2均大于0.998 0，能满足日常水产品中19种QNs抗生素残留监测的需要。

表4 19种QNs抗生素的标准曲线、相关系数及检出限表

2.3 方法回收率和精密度

称取不含QNs抗生素的鱼肉于50 mL具塞离心管中，添加10 ng·mg-1、20 ng·mg-1、60 ng·mg-1的19种QNs抗生素进行回收率实验，添加QNs抗生素混合标准溶液后拧紧盖子后放置于4 ℃条件下过夜，同时进行3个样品的平行实验，重复3次。由表5可知， 19种QNs抗生素的加标回收率在69.23%～96.28%，相对标准偏差在6.28%～9.86%，方法具有较好的精密度和回收率。

表5 鱼肉中19种QNs抗生素的平均加标回收率与精密度表

2.4 实际样品的测定

采用本文建立的检测方法对中山市水产养殖渔塘中35个鱼肉样品（其中乌鳢7个、鳙鱼9个、罗非鱼9个以及草鱼10个）进行测定，结果表明19种QNs抗生素均未检出。

3 结论

本文建立了高效液相色谱串联质谱法测定鱼肉中多种QNs抗生素残留的监测方法。该方法具有分析时间短、操作简单、定性准确性高及检出限低等优点。标准《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法》（农业部1077号公告—1—2008）中包括了15种喹诺酮类的检测方法，但标准的分析时间较长。本文对前处理提取液进行优化，方法具有较好的精密度和回收率，能满足日常大批量监测的需要。