白及多糖的超滤陶瓷膜分离工艺研究 *

张丽华

(1.陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳 712046； 2.陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046)

白及,兰科植物白及Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f.的干燥块茎，气微，嚼之有黏性。白及在止血消肿方面有一定的作用，《吉人集验方》中记载，单味研末，糯米汤调服。它还可治疗手足皲裂，研磨成粉后促进伤口的愈合[1]。研究发现[2-7]，白及多糖具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等功效。白及多糖能够收敛止血，促进上皮组织修复，帮助伤口愈合等[8]，多作为医药原料、生物医学材料和免疫调节剂[9]等。膜分离技术是一种采用选择性渗透膜作为分离媒介，利用化学位差或外部能量作为推动力的分离工艺技术，实现对某一类物质的分离、提纯和浓缩[10-14]。膜分离技术能够有效保留功效成分的活性，而且其选择性强，操作过程简单，适用范围广，能耗低，广泛应用于医药生产过程中[15-17]。陶瓷薄膜管壁上存在着许多微小的滤孔，在一定的压力下，物质在膜内或膜外流动，小分子或一些液体可以穿过薄膜，而大分子或固体无法穿过薄膜，从而实现对物质的分离、纯化和浓缩[18-20]。鉴于此，本研究采用膜分离技术分离纯化白及多糖，降低多糖损失率，得到简单、高效的多糖分离方法，为白及多糖进一步研究提供一定的理论依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 FA1004型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；OSB-2100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型真空泵(西安予辉仪器有限公司)；DS5紫外可见分光光度计(英国爱丁堡仪器公司)；DHG-9075型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；HH-S4型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；BSM-CMZ-01G型陶瓷膜分离设备(上海碧欣生物设备工程有限公司)。

1.2试药 白及粗多糖为实验室自制，苯酚-硫酸法测定多糖含量为60%。无水乙醇(安徽安特食品股份有限公司，分析纯)；苯酚(天津市恒兴化学试剂制造有限公司，分析纯)；浓硫酸(天津科密欧化学试剂有限公司，分析纯)。

2 方法

2.1原料预处理 取实验室自制的白及多糖提取物，在40 ℃水浴下配制成相应浓度的白及多糖溶液，用定性滤纸和布氏漏斗抽滤不溶物。

查阅众多文献可知，白及多糖的分子量存在多样性，主要分子量分布在1×105～3×105之间，本研究选用50 kD的陶瓷膜进行多糖分离工艺研究[21]。

2.2多糖含量的测定

2.2.1葡萄糖标准曲线的绘制 采用苯酚-硫酸法测定葡萄糖标准曲线：取经105 ℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品50 mg,精密称定，置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1 mg·mL-1的标准母液。在每次测量前，都要先用蒸馏水把母液稀释成0.1 mg·mL-1的标准溶液，精密吸取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的葡萄糖标准溶液，分别置于10 mL的具塞试管中，用蒸馏水补足至1 mL，依次加入5%的苯酚1 mL，5 mL的浓硫酸，摇匀，显色反应15 min后，在490 nm处测定吸光度值[22]。以未加入葡萄糖溶液的样品作为空白，以溶液中葡萄糖的质量浓度(mg·mL-1)为横坐标，吸光度为纵坐标，得到葡萄糖标准曲线回归方程为：Y=9.0458X-0.0084(r=0.9996)，葡萄糖在0.02～0.1 mg·mL-1浓度范围内呈良好线性关系。

2.2.2多糖的含量测定 应用苯酚-硫酸法：精密吸取相应浓度的多糖溶液1 mL，置于10 mL的具塞试管中，用蒸馏水补加至1 mL，然后再依次加入5%的苯酚溶液1 mL和5 mL的浓硫酸，摇匀，显色反应15 min后，测量在490 nm处的吸光度值，并计算出多糖的含量。

白及多糖回收率计算公式为 ：

注：C为白及多糖滤液的浓度(mg·mL-1)；V为白及多糖滤液的体积(mL)；m为预处理前的白及粗多糖质量(g)。

2.3膜分离实验方法 用陶瓷膜分离设备(陶瓷膜分离流程示意图见图1)分别过滤各多糖溶液。

2.3.1单因素实验

2.3.1.1温度对多糖回收率的影响 先取备用液料液比为6 mg·mL-1的多糖溶液，再设定陶瓷膜分离设备膜压为2.0 bar，冲洗次数为5次，分别在温度为30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃下，分离多糖溶液，收集滤液，采用苯酚-硫酸法测量多糖的回收率。

2.3.1.2料液比对多糖回收率的影响 设定陶瓷膜分离设备膜压为2.0 bar，温度45 ℃，冲洗5次，分别在料液比为2，4，6，8和10 mg·mL-1下，分离多糖溶液，收集滤液，采用苯酚-硫酸法测量多糖的回收率。

2.3.1.3膜压对多糖回收率的影响 先取备用液料液比为6 mg·mL-1的多糖溶液，温度45 ℃，冲洗5次，再分别设定陶瓷膜分离设备膜压为1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 bar，分离多糖溶液，收集滤液，采用苯酚-硫酸法测量多糖的回收率。

2.3.1.4冲洗次数对多糖回收率的影响 先取备用液料液比为6 mg·mL-1的多糖溶液，设定膜压2.0 bar，温度45 ℃，冲洗次数分别为1、2、3、4、5，分离多糖溶液，收集滤液，采用苯酚-硫酸法测量多糖的回收率。

1.料液贮罐;2.缓冲罐;3.压力表;4.温度表;5.透过液流量计;6.循环液流量计;7.膜组件;8.截止阀;9.蠕动泵;10.箱体

2.3.2响应面实验设计 在单因素试验结果的基础上，以多糖回收率为考察指标，并利用Box-Behnken[24]的基本原理，筛选出三个对多糖回收率有重要影响的因素：料液比(A)、温度(B)、膜压(C)，进行实验，确定膜分离白及多糖的最佳工艺，因素水平见表1。

表1 响应面因素水平设计表

3 实验结果与分析

3.1单因素试验结果

3.1.1温度对多糖回收率的影响 多糖回收率与温度的变化关系如图2所示，曲线从30 ℃到45 ℃时一直呈上升趋势，45 ℃后略微下降。当溶液温度为45 ℃时，多糖回收率达到最大，然而当温度超过45 ℃时，多糖回收率逐渐减小。过高的温度不仅会对白及多糖的稳定性产生影响，还会影响膜装置的使用寿命，所以溶液温度为45 ℃左右较为理想，此时多糖回收率最大。

图2 温度的影响

3.1.2料液比对多糖回收率的影响 多糖回收率与料液比的变化关系如图3所示，曲线从开始一直呈上升趋势，当料液比为6 mg·mL-1时，白及多糖回收率达到最大，6 mg·mL-1后呈缓慢下降趋势。这主要是由于随着料液比的增大，膜的表面的凝胶层及流动边界层厚度减小，而浓差极化作用减弱，从而提高了多糖回收率。当料液比增加到6 mg·mL-1后，多糖回收率基本趋于稳定。然而当物质-液体的比率持续增加时，溶液的黏度也会增大，阻力也在增加，因为一些溶质沉积在膜的表面，很容易堵塞膜孔，膜孔堵塞就使液体难以通过膜，增大了溶液通过膜界面的阻力，从而导致多糖回收率下降。因此，选择料液比为6 mg·mL-1左右较为合适。

图3 料液比的影响

3.1.3膜压对多糖回收率的影响 多糖回收率与膜压的变化关系如图4所示，从1.0 bar膜压增大，曲线呈明显上升趋势，当膜压为2.0 bar时，多糖回收率达到最大，之后趋于平缓。这主要是因为膜的压力增大，膜分离的推动力增强，多糖就比较容易透过膜。随着压力的升高，造成了许多大分子溶质的吸附和积聚，膜的表面堆积了许多难以让溶液持续透过的物质，使得凝胶层的厚度和密度增加，膜被压密，从而使传质阻力增加，影响了多糖的回收率。因此，膜压为2.0 bar左右较合适。

图4 膜压的影响

3.1.4冲洗次数对多糖回收率的影响 多糖回收率和冲洗次数的变化关系如图5所示，随着冲洗次数的增加，多糖回收率呈上升趋势，当冲洗次数达到5次时，多糖回收率达到了82.5%。这是因为膜在使用过程中，凝胶极化使胶体层的厚度增加，同时，溶质在膜的表面形成了吸附层而堵塞膜孔，所以多次冲洗膜表面对于清理膜孔有着十分重要的作用，膜孔疏通才有利于提高多糖的回收率。

图5 冲洗次数的影响

3.2响应面优化试验结果与分析

3.2.1响应面试验设计结果 根据上述单因素试验的结果,按照Box-behnken[24]方法设计的原理,主要考察的因素为液料比(A)、温度(B)、膜压(C)，多糖回收率为响应值,试验中的设计和结果如表2所示。

表2 响应面实验方案设计与结果

应用Design-Expert 12.0.3软件进行了数据的分析，响应变量为液料比(A)、温度(B)、膜压(C)，响应值为多糖回收率(Y)，按照所设计的响应面方案进行试验，并对所得到的试验结果通过回归拟合分析后得到方程为：

Y=78.44-0.900A+3.4B+1.23C-2.35AB-1.90AC+1.35BC-8.65A2-6.34B2-6.44C

通过上表可以看出，回归模型显著(P<0.05)失拟误差的值为0.2206，是不显著因素，方程中的A2的影响结果为极显著，B和AB的影响结果为显著。结果表明模型r=0.9858，radj=0.9673，均接近1.0，这说明该回归模型线性关系良好，与实际结果具有高度相关性，可准确反映各因素与响应值之间的关系，其可信度较好；而它的变异系数CV=2.80%<5.0%，由此可以看出，模型外因素对响应值的影响不明显，可以考虑将该模型用在对实际实验结果的预测上。

3.2.2响应曲面分析 料液比和温度、料液比和膜压、温度和膜压这几个因素交互影响的显著差异如图6所示。由响应面图可得，膜压和温度以及料液比各单因素之间交互影响，存在显著性差异，当得到的响应面图倾斜程度越低，坡度较缓，等高线越趋于圆形时，则两个单因素交互影响越小；反之，则两个单因素间的交互影响显著。由图6可看出，这三个单因素之间的交互影响均较大，三个因素对应的曲线当中，变化最大的、最陡峭的是温度的变化曲线，膜压次之，料液比最小。

(a) 料液比、温度的影响 (b)料液比、膜压的影响 (c) 温度、膜压的影响

对回归方程求一阶偏导，由此可得白及多糖的膜分离最佳工艺条件为：温度46.519 ℃、料液比5.781 mg·mL-1、膜压2.072 bar，白及多糖的回收率达79.092%。综合考虑预测的实验结果和实际操作工艺条件，微调工艺参数为温度为47℃、料液比6 mg·mL-1、膜压2 bar，在此工艺条件下重复操作三次，得到的多糖回收率平均都在78.44%，这说明可以用此模型来分析和预测白及多糖的膜分离工艺。

4 总结与讨论

本研究以白及多糖为原料，以白及多糖的回收率为指标，采用膜分离纯化白及多糖，在单因素实验基础上，选择响应面法进行进一步优化，得到的最优工艺参数为：温度47 ℃，料液比6 mg·mL-1，膜压2 bar，白及多糖的回收率达78.44%。本研究对白及多糖的分离纯化起到了较好的效果，为白及多糖的进一步研究奠定了一定的基础。

多糖的分离方法有多种，本研究采用膜分离工艺，具有以下优势：操作简便、分离效率高、环境污染小、能耗低、节约资源等。在实际生产中，膜分离根据分离物质的孔径进行分离，具有较强的选择滤过性，同时分离过程中会造成有效物质有一定的损失，需要根据不同的情况对工艺进行合理的选择。随着制剂工艺的发展，对多糖分离的效率和品质有了更高的要求，我们也要与时俱进，不断创新，引入新技术新方法充实该领域，探索出更加稳定高效的多糖分离方法。