紫椴种子萌发特性及休眠解除方法研究

王因花，孔雨光，李庆华，吴德军，燕丽萍，许 涛，鲁仪增，翟国锋

（1山东省林业科学研究院/山东省林木遗传改良重点实验室，济南 250014；2山东省国土空间规划院，济南 250014；3济南市园林和林业科学研究院，济南 250000；4山东省林草种质资源中心，济南 250014；5淄博市鲁山林场，山东淄博 256100）

0 引言

紫椴(Tilia amurensis)为椴树科、椴树属的落叶乔木，东北地区主要的造林树种，集观赏、用材、经济、食用、药用等多种价值于一体，尤以质量优良的椴树蜜著称。目前，紫椴资源日益减少，已被列入国家二级保护植物[1]。多年来，滥砍乱伐导致紫椴种群的数量大大下降，加之紫椴种子具有深休眠的特性，仅依靠其自身自然繁殖难以满足保护这一珍贵树种的需要。因此，探明紫椴种子休眠原因并找到打破休眠的方法对于保护紫椴这一珍贵资源显得尤为重要。

休眠是椴树属植物种子的共性[2]。对于椴树属植物种子休眠的原因，学者们很早就展开了研究，邹学忠等[3]认为紫椴种皮结构致密，透水透气性差，种皮、胚乳均含有发芽抑制物质是导致紫椴种子休眠的主要原因，这与王海南[4]的观点较为一致；刘艳秋[5]通过对紫椴种子解剖构造的观察及对种皮透性和种子内发芽抑制物的测定，认为发芽抑制物是引起紫椴种子休眠的主要因素；尹黎燕等[6]则认为椴树种子的休眠是多种因素造成的，除坚硬的种皮和发芽抑制物质外，种子本身也存在生理后熟；也有学者认为紫椴种皮的致密性结构导致了紫椴种子的休眠[7]。史锋厚等[8]通过对南京椴种子休眠机理的研究，认为胚乳是造成南京椴种子休眠的关键因素，但其作用机理如何尚需更深入的研究；欧洲银叶椴的果皮、种皮存在严重的透性障碍，种子各部分都存在大量的抑制物质导致了其深度休眠[9]；王九龄等[10]通过对紫椴的种皮构造、生理后熟、发芽抑制物等方面的研究认为，紫椴种子的休眠是由综合因素造成的，抑制物质的存在是其中一个重要原因。

本研究在已有研究的基础上，对紫椴种子的萌发特性进行了探讨，并以此为依据进行了休眠解除方法的研究，以期能为加快紫椴种苗繁育提供一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用紫椴种子采自山东省济南市泉城公园。去掉果皮及杂物，取其干净种子为实验材料，千粒重为44.3g。

1.2 实验方法

1.2.1 种子透性研究 取未经处理的种子（以下简称对照种子）和经浓H2SO4处理5分钟的种子各100粒，称重后放入烧杯中，在25℃的恒温条件下进行吸胀实验，每隔12 h取出一次，吸干表面水分后进行称重，直至种子恒重饱和为止，计算各自的吸水率，每个处理3次重复。吸水率的计算见公式(1)。

1.2.2 种子萌发特性探究 将紫椴种子进行不同程度的剥除处理后进行发芽试验，每处理取50粒种子，重复3次。具体剥除部位见表1。

表1 紫椴种子萌发特性试验设计

1.2.3 种子休眠解除方法的研究 采用随机区组实验设计，分别采用浓H2SO4处理+低温层积、GA3处理+低温层积、浓H2SO4处理+GA3处理+低温层积的方法，进行紫椴种子休眠解除方法的探讨，以未经处理的种子为对照，低温层积前具体的种子预处理方法见表2。预处理后，随即在0～5℃的条件下对种子进行低温混沙层积；种子发芽测定温度皆为25℃，光照8 h。

表2 紫椴种子休眠解除方法试验设计

1.2.4 统计分析 采用Excel进行数据统计，SPSS 23.0进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 种皮透性探究

对照种子及经过浓H2SO4处理的种子吸水情况见图1。由图1可以看出，无论是对照种子还是酸蚀处理的种子，前12 h都是其快速吸水期，12 h以后两者的吸水率增加幅度都趋于平缓。但由图1中可以看出，酸蚀种子的吸水率明显高于对照，浸泡12 h时，酸蚀种子吸水率为59.7%，而对照种子的吸水率仅为14.9%，至吸水饱和，酸蚀种子吸水率为73.0%，对照种子吸水率为20.3%。方差分析表明，两者差异达极显著水平(P<0.01)（方差分析表略）。

图1 紫椴种子吸水曲线

2.2 紫椴种子萌发特性探究

2.2.1 紫椴完整种子萌发情况 将紫椴完整种子置于脱脂棉上进行培养，30天内紫椴种子萌发率为0，说明紫椴种子存在休眠，不加处理很难萌发（见图2）。

图2 完整种子萌发情况

2.2.2 带完整胚乳种子萌发情况 将紫椴种皮剥去，保留完整胚乳，置于脱脂棉床观察其萌发情况。结果表明，去掉种皮以后紫椴种子的萌发率依然很低。第1周未见有种子萌发，第2周有4%的种子萌发，至第30天发芽实验结束，发芽率未再增长。说明去掉种皮以后，紫椴种子仍不能顺利萌发，由此可以看出，种皮并不是制约紫椴种子萌发的关键因素，胚乳对种子的萌发可能有很大的制约作用（见图3）。

图3 全胚乳种子萌发情况

2.2.3 剥除部分胚乳（根尖未露出）的紫椴种子萌发情况 去掉种皮，随机切除部分胚乳（远离根尖端），置于脱脂棉床进行培养。置床培养第1周，有6%的种子萌发出幼根，第2周共有20%的种子萌发，幼根呈现出明显的伸长生长，且有白色根毛生出；第3周开始有部分萌发出幼根的种子子叶突破胚乳展开，至第4周发芽实验结束，紫椴种子的萌发率为23.3%（见图4）。

图4 去掉部分胚乳的种子萌发情况

2.2.4 露出根尖的紫椴种子萌发情况 去掉紫椴种皮，并小心剥除包被根尖部分的胚乳（胚乳帽），露出根尖，置于脱脂棉床进行培养。培养第1周种子变化不大，第2周即有42%的种子胚根出现伸长生长，并有部分种子长出白色根毛，第3周已有64%的种子萌发出幼根，但仅有18%的种子子叶突破胚乳而展开，至第4周实验结束，有84.7%的种子萌发出幼根，但其中仅有26%的种子子叶可以突破胚乳，子叶未突破胚乳的种子，其幼根的伸长生长也较差（见图5）。

图5 露出根尖的种子萌发情况

2.2.5 紫椴离体胚萌发情况 去掉紫椴种子的种皮和全部胚乳，将完整的离体胚取出置于脱脂棉床进行培养。结果表明，紫椴离体胚萌发迅速，置床第2天即可见胚根及下胚轴有明显的伸长及弯曲生长，第1周即可见子叶变绿，第2周幼根变为红色并有白色根毛出现，至第3周，各离体胚已生长成为健壮完整的幼苗，紫椴离体胚萌发率达100%，由此可见紫椴的种胚本身并不存在休眠（见图6）。

图6 离体胚萌发情况

对各处理下紫椴种子的发芽率进行方差分析及多重比较，结果表明（见表3）。各处理的发芽率差异达到了极显著水平（P<0.01，方差分析表略）。由此可见，不同的胚乳切除方式对紫椴种子发芽率的影响很大，胚乳在紫椴种子的休眠中起到了关键作用。

表3 不同处理方式下紫椴种子发芽率多重比较

2.3 种子休眠解除方法的研究

2.3.1 单独使用浓H2SO4处理对紫椴种子萌发的影响将紫椴种子用浓H2SO4分别处理5、10、15 min后进行低温层积，30天后取出做发芽实验，结果见表4。由表4中结果可以看出，单独使用浓硫酸处理在短时间内并不能解除紫椴种子的休眠，层积30天紫椴种子发芽率最高仅有14.3%。

表4 浓H2SO4处理时间和GA3浓度对紫椴种子发芽率的影响

2.3.2 单独使用GA3处理对紫椴种子萌发的影响 分别用200、500、800 mg/L的GA3溶液浸泡紫椴种子12 h，而后再对种子进行低温层积处理，30天后取出做发芽实验，结果见表4。可以看出，单独使用GA3处理对促进种子萌发的作用较小，层积第30天发芽率仅有3.0%左右，各浓度对种子萌发的影响差异不显著，说明单独使用GA3并不能解除紫椴种子的休眠。

2.3.3 综合处理对紫椴种子萌发的影响 为快速解除紫椴种子的休眠，在短时间内获得理想的发芽率并提高出苗整齐度，对紫椴种子采取了综合处理措施，即浓H2SO4处理+GA3处理+低温层积。种子经综合处理后，仅经过10天的低温层积，11号处理和14号处理的种子裂口率便达到了59.3%和64.3%，并且有部分种子已经萌发出幼根；层积至30天时，大部分处理的种子裂口率达到了70%以上，此时取出种子，置于25℃条件下进行发芽实验，各处理的种子均获得了较高的发芽率（图7）。由图7可以看出，除9号处理外，其余8个处理的紫椴种子发芽率都达到了80.0%以上，其中以14号处理（浓H2SO4处理15 min+500 mg/LGA3处理12 h）效果最好，发芽率达92.0%，其次为13号处理（浓H2SO4处理15 min+200 mg/L GA3处理12 h）和11号处理（浓H2SO4处理10 min+500 mg/L GA3处理12 h）发芽率，分别为89.0%和88.0%，三者之间差异不显著。方差分析表明，各处理的发芽率与对照的发芽率都达到了极显著差异（方差分析表略），对照发芽率最低，仅有1.0%。

图7 各处理对紫椴种子发芽率的影响

进一步对浓H2SO4不同处理时间和GA3不同浓度下的发芽率进行分析，结果表明，两者对紫椴种子发芽率的影响均达到了极显著水平（P<0.01，方差分析表略）。多重比较结果表明（见表5），随着浓H2SO4处理时间的延长，紫椴种子发芽率逐渐提高，随着GA3浓度的提高，紫椴种子发芽率呈现出先升高后降低的趋势，GA3浓度在200 mg/L和500 mg/L时，种子发芽率差异不明显，但当浓度达到800 mg/L时，种子发芽率下降，与前两者的差异达到极显著水平（见表5）。

表5 综合处理中浓H2SO4及GA3处理对紫椴种子发芽率的影响

3 讨论与结论

植物种子休眠是一种复杂的生理现象，是植物在长期进化过程中为适应外界不良环境形成的一种自我保护机制。关于种皮在种子休眠中所起的作用，多数观点认为是由于存在透性障碍、机械障碍、存在发芽抑制物或者由上述因素共同作用所致。魏灵敏等[11]认为种皮的机械障碍及种皮内抑制物的存在是导致拐枣种子休眠的主要原因；韩月乔等[12]认为白藓种子休眠是种皮内含有发芽抑制物质及胚根休眠导致的；马占相思种子的种皮不透性是其休眠的原因，起主导作用的是其致密的栅栏组织[13]。本研究中，紫椴种子经酸蚀处理后吸水率大大提高(73.0%)，而对照种子的吸水率仅为20.3%，远低于种子萌发所需的基本吸水率(40%)[12]，由此可见紫椴种子存在一定的透性障碍，可能是这种透性障碍在一定程度上限制了紫椴种子胚与外界进行水分与气体交换，从而抑制了种子的萌发[14]，这与周健等[15]在对大花四照花种子的研究中得出的结论较为一致。但通过紫椴种子的萌发特性研究可知，去掉种皮以后，保留全胚乳的紫椴种子依然不能顺利萌发，发芽率仅有4.0%，这说明胚乳是引起休眠的重要原因之一，这与杜凤国等[7]的研究结论不同。 史锋厚等[8]在对南京椴的研究中也认为，种皮并不是造成南京椴种子休眠的主要因素。

去掉种皮后，进一步对紫椴的胚乳进行不同的切除处理，结果表明，紫椴种子的离体胚发育完整，萌发迅速，萌发率可达100%，说明紫椴种子的休眠不是胚性休眠，也不存在生理后熟现象，其休眠是由胚外因素导致的，这与王九龄等[10]的观点一致。切除部分胚乳但胚根没有露出的种子，其萌发率仅为23.3%；剥除胚乳帽使根尖露出的种子，萌发率可达84.0%，但在萌发的种子中仅有26.0%的种子子叶可以突破胚乳的束缚而展开；而保留全胚乳的种子萌发率仅有4.0%。由此可见，胚乳对紫椴种子的萌发有很大的限制作用，尤其是胚乳帽的限制作用最大，这与卢明艳等[16]在对无髯鸢尾种子的研究中得出的结论类似，她们认为珠孔端的胚乳是造成5种野生无髯鸢尾种子休眠的主要因素。李成浩等[17]通过对五味子种子休眠原因的研究，也指出胚乳的机械障碍是导致五味子休眠的主要原因之一。另有研究指出，胚根进行伸长生长并突破周围的包被物是种子完成发芽的标志，而促进胚根进行伸长生长的原因之一就是胚根顶端外围组织束缚力的降低[18]；去掉细叶鸢尾珠孔端的胚乳，使其胚根露出，细叶鸢尾随即就能顺利萌发[19]；黄精种子的种胚跟紫椴种子的种胚一样被胚乳完全包被，且胚乳厚而致密，其萌发的过程伴也随着胚乳的弱化[20]。本研究中，紫椴的离体胚和露出根尖的种子萌发率显著高于其他处理的种子，此结果恰好印证了这一点。故可推测，胚乳尤其是胚乳帽的机械障碍是造成紫椴种子休眠的主要因素。当前已有很多的研究提出并证实了这一观点，即很多种子的休眠都是由于种皮或胚乳的机械障碍引起的[21-22]。

从生物力学的视角出发，种子覆盖物的弱化以及胚的生长潜力共同调控种子的萌发，种子能否萌发取决于胚生长产生的动力及种子覆被物（种皮、胚乳）所产生的机械阻力之间的平衡[23]，如何削弱其作用，是促进种子萌发的关键所在。破坏种皮结构可以增强种皮透性，减小种皮的机械阻力，并有利于供给种胚生长发育所需的水气条件。浓硫酸常被用来处理种皮坚硬的种子，本研究中，致密坚硬的紫椴种皮经浓硫酸处理后变薄变软，透性增强，这是解除紫椴种子休眠的首要条件，但仅仅使用浓硫酸处理在短时间内并不能打破紫椴种子的休眠，需要与GA3处理和低温层积相结合才能达到快速解除紫椴种子休眠的目的。

GA3已被广泛应用于种子休眠的处理中[24-26]，GA3促进种子萌发至少有两种作用，即增强胚的生长势和软化胚周围组织（如种皮和胚乳）以利于胚根的突破[27]。Jinrong Peng等[28]在对番茄种子的研究中指出，番茄GA缺乏突变型的种子(gib-1)在没有外源赤霉素情况下是不能萌发的，但如果去掉胚乳帽便可顺利萌发，他们的这一结论与本实验的研究结果高度一致，故可推测，GA3在这些种子中的作用可能是诱导使胚乳强度减弱的酶的活性，从而削弱胚乳的机械障碍。正在发芽的野生型番茄种子中，由于β-甘露聚糖内酶的作用，使胚根穿透富含甘露聚糖的胚乳细胞壁所需的穿透力降低[29]，这个酶最先产生于发芽孔周围，发芽后再产生于胚乳的其它部位[30-31]。笔者在对南京椴种子休眠机理的研究中发现，GA3最重要的作用很可能就是诱导降解细胞壁的酶的产生来弱化胚乳对种胚生长的机械阻力，以及诱导降解胚乳细胞内大分子不溶营养物质的酶的出现[32]。但单独使用GA3不能解除紫椴种子的休眠，需与浓硫酸处理和低温层积处理结合使用才能发挥其作用。

综上所述，浓硫酸处理+GA3处理+低温层积是快速解除紫椴种子休眠的有效方法，单独使用浓硫酸或GA3都不能在短时间内取得理想的效果。但由于浓硫酸腐蚀性强，容易对种子造成伤害，在生产上大规模应用有一定的难度，可以考虑使用热水或其他腐蚀性较小的试剂代替浓硫酸，这需要在生产中不断摸索实践。