无创筛查非酒精性脂肪性肝病相关肝纤维化新血清标志物

赵晓彤，曹武奎(通信作者)

天津市第二人民医院检验科 (天津 300192)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与胰岛素抵抗和遗传乙肝密切相关的代谢应激性肝损伤。疾病谱包括非酒精性单纯性肝脂肪变、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。NAFLD不仅可导致肝病患者残疾和病死，还与代谢综合征、2型糖尿病、动脉粥样硬化性心血管疾病及结直肠肿瘤等高发疾病密切相关。目前，NAFLD已成为我国第一大慢性肝病和健康查体肝酶异常的首要原因，且越来越多的慢性乙型肝炎病毒感染患者合并NAFLD，严重危害患者的生命健康。同时，NAFLD也正成为世界肝病的主要病因。据统计，NAFLD的全球流行率约为25%[1]。亚洲国家的NAFLD患病率约为27.4%[2]。据报道，肥胖(51.34%)、高脂血症(69.16%)、高血压(39.34%)和代谢综合征(42.54%)的人群患有NAFLD的概率更高[3-5]。

NAFLD的典型临床进展路径是：NAFLD—NASH—纤维化—肝硬化—肝功能衰竭—HCC。临床发现高达50%的HCC病例可能发生在没有肝硬化的情况下[6-7]。15%～20%的NAFLD患者可进展为NASH，30%～40%的NASH患者可发展为纤维化，其中15%～20%的NASH患者可进一步进展为晚期纤维化(F3/F4期肝纤维化)或肝硬化(F4期肝纤维化)[8]。然而，NAFLD患者在没有NASH的情况下也可能会发展为纤维化[9]。NAFLD与肝脏相关病死率、肝癌和总病死率的增加有关[5,10]。严重肝病的风险比随着纤维化分期的增加而增加，而NASH不存在纤维化风险[11]。纤维化阶段是NAFLD疾病特异度病死率的最强预测因子[12]。没有其他组织学特征的纤维化阶段可预测NAFLD的全因病死率和疾病特异度病死率[13]。晚期纤维化是导致NAFLD患者病死的独立预测因子[14]。NAFLD病死率随着纤维化分期的增加呈指数增加[15]。

因此，早期发现NAFLD患者纤维化对于控制与这种高度流行疾病相关的病死率至关重要。现对NAFLD的非侵入性血液生物标记物的最新进展进行综述，以辅助临床诊断。

1 单项生物标志物的研究进展

肝纤维化是一种由各种原因(肝炎、毒素、游离脂肪酸等)引起的自然伤口愈合反应，可引起炎症和肝细胞损伤。肝纤维化主要的细胞过程包括激活肝星状细胞，肌成纤维细胞和细胞外基质的形成，肝细胞的减少，细胞外基质和纤维胶原的积累。参与这些过程的分子可作为生物标志物，包括蛋白质、微小核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)和长非编码RNA。参与调节纤维化形成的生物标志物在辅助诊断肝纤维化中的应用效果优于仅仅是纤维化最终结果的指示物(如胶原蛋白等)。

1.1 多花紫藤凝集素阳性mac-2结合蛋白(wisteria floribunda lectin mac-2-binding protein，WFA+-M2BP)与Ⅳ型胶原氨基末端肽(7S)

Ogawa等[16]检测了WFA+-M2BP和Ⅳ型胶原7S在165例NAFLD患者中的表达情况，经肝活检发现呈显著纤维化表现；以0.83 ng/ml为临界值时，血清WFA+M2BP诊断纤维化阶段≥2期的曲线下面积为0.832(95%可信区间为0.771～0.894)；以5.2 ng/ml为临界值时，血清Ⅳ型胶原7S诊断纤维化阶段≥2期的曲线下面积为0.837(95%可信区间为0.778～0.898)；使用上述截断值，WFA+-M2BP确诊了73.2%的显著纤维化患者，Ⅳ型胶原7S确诊了80.5%的显著纤维化患者，其中62.2%的患者WFA+-M2BP和Ⅳ型胶原7S均超过阈值。

WFA+-M2BP是紫藤凝集素阳性Mac-2结合蛋白，又被命名为M2BPGi，即Mac2结合蛋白糖基化异构体。Mac-2结合蛋白的官方基因名称是半乳凝素3结合蛋白(galectin 3 binding protein，LGALS3BP)(www.genecards.org)。糖蛋白可能是肝纤维化的潜在生物标志物，是否可将更多的糖蛋白作为纤维化的生物标志物有待进一步发现并证实。

1.2 几丁质酶3样蛋白1(chitinase-3-like-1 protein，CHI3L1)和Ⅳ型胶原7S

CHI3L1是一种含383个氨基酸，分子量为42.6KD的单体糖基化蛋白，为糖基水解酶家族成员之一，其可结合壳多糖，但无壳多糖酶的活性，在炎症和组织重塑中起着重要作用。CHI3L1最初被认定为乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒患者纤维化的生物标志物[17-21]。Kumagai等[22]发现，NAFLD患者血清CHI3L1水平会随着肝纤维化程度的加重而升高。

CHI3L1的优势在于其与NAFLD患者的脂肪变性、炎症、细胞膨胀等均无相关性。当与Ⅳ型胶原7S结合使用算法[-0.0545+Ⅳ型胶原7S×0.3456+CHI3L1×0.0024]，截断值为2.06时，曲线下面积增加到0.8763[22]。CHI3L1被包括在NIS4算法中使用α-2-巨球蛋白、微小基因(microgene，MIR)34a、CHI3L1和糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)来识别需要治疗的NAFLD患者[23]。此外，HbA1c与NAFLD患者的纤维化进程有关[23]。当HbA1c水平≥8.0%时，NAFLD患者的肝纤维化概率会增加，当HbA1c水平≥6.5%时，则与潜在的肝纤维化显著相关[24]。

1.3 血清细胞角蛋白18片段(cytokeratin18，CK18-F)

CK18-F可作为NAFLD的非侵入性生物标志物[25]。血清CK18-F水平与脂肪变性、炎症、细胞膨胀以及整体NAFLD活动评分密切相关。以230 U/L为临界值时，CK18-F预测NAFLD的曲线下面积为0.762、灵敏度为0.89、特异度为0.65；以270 U/L为临界值时，CK18-F预测NASH的曲线下面积为0.757、灵敏度为0.64、特异度为0.76。对于NAFLD相关性肝纤维化的分期，CK18-F仅在F0和F1之间差异有统计学意义(P=0.0102)，而在F1、F2、F3和F4之间差异无统计学意义[25]。

1.4 金属蛋白酶组织抑制因子-1

Yilmaz和Eren[26]的研究发现，有明显纤维化的NAFLD患者仅金属蛋白酶组织抑制因子-1水平显著高于无纤维化的NAFLD患者(P=0.03)。

1.5 胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)和胰岛素样生长因子结合蛋白5(Insulin like growth factor binding protein 5，IGFBP5)

Colak等[27]发现，中、重度纤维化患者血清IGF-1浓度明显低于无纤维化或轻度纤维化的患者(P=0.001)；以63.6 mg/L为临界值，曲线下面积为0.85、灵敏度为75%、特异度为91%；此外，中、重度纤维化患者的血清IGFBP5水平明显高于无纤维化或轻度纤维化的患者(P=0.028)；以630.1 mg/L为临界值，曲线下面积为0.74、灵敏度为75%、特异度为80%。

1.6 Ⅲ型前胶原氨基端肽(type Ⅲ procollagen amino peptide，PⅢNP)

PⅢNP是鉴别不同程度NASH的良好标记物[28]。然而，PⅢNP作为区分不同程度纤维化的标记物并不理想，区分F0与F1～2的曲线下面积为0.63，区分F0～1与F2的曲线下面积为0.65。

1.7 白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)

血清IL-8、骨桥蛋白和单核细胞趋化蛋白1与NAFLD患者的肝纤维化相关。在控制了年龄、性别、体质量指数、糖尿病、高血压和代谢综合征状态后，发现IL-8与肝纤维化程度呈显著相关性(P=0.001)[29]。

1.8 循环长链非编码RNA lnc18q22.2

Atanasovska等[30]对来自NASH(48例)、单纯脂肪变性但无NASH(11例)和健康对照(23名)的82例肝活检标本进行了4 383个长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的基因表达谱分析，发现了1个肝脏特异的lncRNA(lnc18q22.2，RP11-484N16.1)，其与NASH分级(r=0.51，P=8.11×10-7)、小叶性炎症(r=0.49，P=2.35×10-6)以及非酒精性脂肪性肝病活动性评分(r=0.48，P=4.69×10-6)相关。然而，是否能在血液中检测到这种lncRNA以及将其作为NALFD肝纤维化生物标志物的性能还有待进一步研究。

1.9 过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ)的血浆脱氧核糖核酸(deoxyriboNucleic acid，DNA)甲基化

当PPARγ基因启动子甲基化阈值为81%时，可将26例经活检证实的NAFLD患者分成轻、重度两组，其曲线下面积为0.91，灵敏度和特异度分别为0.83和0.93[31]。

2 巨噬细胞相关标志物

肝巨噬细胞通过与肝星状细胞和其他免疫细胞相互作用，在炎症和纤维化的调节中发挥重要的作用。因此，通过关注巨噬细胞相关因子来探索可行的肝纤维化生物标志物是合理的。巨噬细胞相关因子主要包含白细胞介素-34、唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素7(Sialic acid binding immunoglobulin like lectin 7，sSiglec7)和可溶性CD163分子(Soluble CD163 molecule，sCD163)。在NAFLD患者的肝脏中，白细胞介素-34由活化的成纤维细胞产生，sSiglec7由巨噬细胞分泌，sCD163是白细胞介素-6诱导的清除结合珠蛋白-血红蛋白复合物的巨噬细胞受体，在巨噬细胞上表达，并在巨噬细胞激活后上调。Soshio和Kanto[32]发现，血清白细胞介素-34、CHI3L1和sSiglec7水平与肝纤维化密切相关，可作为NAFLD/NASH的诊断生物标志物。另外，在慢性乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染和NAFLD患者中，sCD163水平与纤维化分期相关。在NAFLD患者中，sCD163在肝脏的表达与脂肪变性的程度相关。这些标记物检测晚期肝纤维化的灵敏度和特异度各不相同，能分别对NAFLD患者的晚期纤维化，轻、中度纤维化，HCC提供诊断依据。建议将这些标记物与其他方式相结合以辅助诊断。

3 其他相关标志物

目前，NAFLD患者纤维化分期的评估方案是使用生物标记物将患者大致分为无、中度(F0～2)或重度(F3～4)纤维化。从更广泛的公共卫生角度来看，这可能足以识别和分层患者，以便更好地对NAFLD患者进行临床管理或治疗。另一方面，在来自患者的活检样本中，仅因采样错误，导致纤维化诊断错误超过一个分期的发生率高达33.1%[33]。然而，期望生物标记物的表现远远高于活检本身的准确度是不现实的，活检本身的准确度为70%～80%，这取决于医院设备或病理学家的技术水平。现在亟需创新一种方法以取代活检作为金标准，并提出新的指标来评估纤维化生物标记物，或者建立全新的标准，如测量纤维化进展的速度和方向，而非强制进行静态的纤维化分期。比较折中的办法是限制(或集中)生物标记物的应用范围，以此作为辅助判断依据，以最大限度地减少活检次数。在这种情况下，具有高阳性预测值或高阴性预测值的生物标志物检测可帮助识别不需要活检的患者。此外，循序渐进的算法似乎比同时使用所有生物标志物作为综合得分的算法的效果更好[34-35]。蛋白质组学和系统生物学等新技术可能会为评估纤维化分期或进展速度提供进一步的创新[36]。

4 小结

广泛的基础和临床研究已经为肝脏炎症、纤维化进展和癌变的机制提供了有用的信息。NAFLD是一个日益增长的全球公共卫生问题，需要公共卫生诊断、系统科学、营养、肝病和临床肿瘤学领域的学者进行长期研究。目前，针对NAFLD纤维化的标志物众多，包括WFA+-M2BP、CHI3L1、CK18-F、IGF-1等单项生物标志物，以及白细胞介素-34、sSiglec7、sCD163等巨噬细胞相关标志物等。根据无创筛查肝纤维化相关的标志物，可对NAFLD进行早期评估，对控制NAFLD患者的病死率具有重要的临床意义。