C-erbB-2在不同剂量丹参注射液联合泼尼松龙治疗OSF前后的表达变化研究

张国富，杨 帆，郑 玥，肖双霜

（湖北三峡职业技术学院附属医院口腔科，湖北 宜昌 443000）

近年来，人们对口腔疾病的重视度越来越高，但由于人们进食的食物存在多样化，且摄入的高盐、高脂及煎炸食物较多，因此导致口腔疾病的发病率逐年升高，尤其是年轻人的患病率更高。口腔黏膜下纤维化（oral submucous fibrosis，OSF）是一种慢性口腔疾病，可侵犯口腔的任何部位。在患病早期，患者可能表现为无症状，随着病情的发展会出现口腔内烧灼感，尤其在进食刺激性食物时表现更为明显，后期可出现吞咽困难、口腔黏膜变白、出现纤维条索等表现[1]。OSF 属于口腔癌癌前病变，病因复杂，其发生与多种癌基因相互作用有关。本研究拟通过对OSF 组织进行检测，观察C-erbB-2 在各组标本中表达的差异性来探讨运用丹参注射液联合泼尼松龙治疗OSF 的精确剂量，以达到最佳的临床效果。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 基线资料

随机选取2019 年3 月至2021 年5 月间在我院口腔科、宜昌市中心医院口腔科，宜昌市第一人民医院口腔科进行治疗的69 例OSF 患者作为研究对象，其治疗方案均为丹参注射液联合泼尼松龙，根据用药剂量的不同将其分为小剂量组（A 组）、中剂量组（B 组）、高剂量组（C 组），每组各23 例。随机选取同时期我院收治的10 例口腔黏膜正常患者作为对照。病例纳入标准：OSF 患者的病情经临床检查得到确诊；入组前未接受过相关治疗；病理资料齐全；自愿参与本研究。在69 例OSF 患者中，有男性36 例，女性33 例；其年龄为26 ～67 岁。在10 例口腔黏膜正常患者中，有男性5 例，女性5 例；其年龄为22 ～56 岁。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂 C-erbB-2 单克隆抗体（克隆系CBll）及SP 试剂盒，均购自上海博英生物有限公司；二步法检测试剂盒、即用型SABC 试剂盒、酶底物DAB 显色剂，均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 检测方法 免疫组化二步法（S-P）：取新鲜的口腔黏膜组织（包括OSF 组织与正常口腔黏膜组织），使用甲醛进行固定，甲醛浓度为4%。固定后用石蜡包埋，然后制备成5 μm 的切片，并对切片进行免疫组化染色，具体步骤：1）对制备好的载玻片进行去污处理，即使用浓硫酸重铬酸钾洗液浸泡。浸泡24 h 后进行防脱片处理，即浸泡在多聚赖氨酸稀释液中24 h。处理后放在干燥箱中烘烤50 min。2）使用烤片机对载玻片进行烘烤，烘烤温度为60℃，烘烤时间为4 h。3）置入100% 的二甲苯、95% 和80% 的酒精内进行脱蜡、水化处理。4）置入双氧水（3%）中浸泡10 min 后，使用PBS 缓冲液进行冲洗，每次冲洗时间均为3 min，连续冲洗3 次。5）进行抗原热修复：将载玻片浸泡于盛有柠檬酸盐缓冲液的高压锅中进行加热，保持水沸腾状态2 min，之后放置于室温下进行冷却。6）添加一抗，工作液为p53 和Bcl-2，在冰箱内孵育过夜，冰箱内温度为4℃恒温，然后使用PBS缓冲液连续冲洗3 次，每次冲洗时间均为5 min。7）添加试剂1，在室温下孵育20 min，再使用PBS 缓冲液冲洗3 次，每次冲洗时间均为3 min。8）添加试剂2，在室温下进行孵育，时间为30 min，再次使用PBS缓冲液冲洗3 次，每次冲洗时间均为3 min。9）进行DAB 显色：在室温环境下进行反应，经镜下控制反应时间，最后以自来水冲洗结束反应。10）使用苏木素复染，使细胞核着色、脱水，最后应用透明、中性树脂封片。

1.2.3 结果判读 C-erbB-2 蛋白大部分表达于细胞浆内，颜色为棕黄色颗粒。在高倍镜下对检测结果进行判读，具体判读方法参考Campo 等[2]制定的标准：0 分：基本不着色；1 分：弱着色；2 分：中度着色；3 分：强着色。阳性细胞数所占比例共计分为四个评分等级：0 分：0% ～5% ；1 分：6% ～25% ；2 分：26% ～50% ；3 分：50% 以上。最后判读结果= 阳性细胞所占比例+染色强度分值，0 分：阴性（-）；1 分：弱阳性（+）；2 分：弱阳性（+）；3 分：中等阳性（++）；4 分：中等阳性（++）；5 分及以上：强阳性（+++）。

1.3 观察指标

观察C-erbB-2 蛋白在OSF 组织与正常口腔黏膜组织中的表达情况。

1.4 统计学处理

采用SPSS20.0 统计软件进行数据处理，计量资料以均数± 标准差（±s） 表示，组间比较采用秩和检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

C-erbB-2 蛋白大部分表达于细胞浆内，颜色为棕黄色颗粒。C-erbB-2 蛋白阳性细胞主要分布在口腔黏膜组织的上皮基底层；在OSF 组织中的表达为治疗剂量越大，其增加程度越小；治疗剂量越小，其增加程度越大。C-erbB-2 蛋白在正常口腔黏膜组织及C 组、B 组、A 组口腔黏膜组织中的阳性细胞数呈逐渐增加的趋势，且分布范围为逐渐从上皮基底层向表层扩散。见图1。正常口腔黏膜组织中细胞周期蛋白依赖性激酶2 关联蛋白1（CDK2AP1）的平均阳性率为（1.24±2.72）%，OSF 治疗组上皮细胞平均阳性率：A 组：（26.71±8.93）% ；B 组：（22.41±5.91）% ；C 组：（18.24±6.43）%，组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

图1 C-erbB-2 蛋白在正常口腔黏膜组织及C 组、B 组、A 组口腔黏膜组织中的分布情况

表1 各组细胞C-erbB-2 蛋白的阳性率（%）

3 讨论

C-erbB-2 是一种细胞来源癌基因，临床上对其进行的研究主要集中于基因蛋白产物（P185）的过度表达和扩增方面[3]。研究发现，C-erbB-2 基因的产物是一种细胞膜受体，该蛋白与表皮生长因子受体（EGFR）有高度的同源性，与未知配体结合后，经蛋白激酶活性的刺激，可进一步促进细胞的分裂、增殖和转化。C-erbB-2 的扩增或表达一般见于乳腺癌、卵巢癌、胃癌、食管癌和肺癌等组织中，这证明其参与了某些癌症的发生及发展[4]。正常状态下，C-erbB-2均为未激活状态，但当机体受到相关因素影响并出现变化后，其可能被激活，并出现向肿瘤转化的活性。C-erbB-2 的激活过程主要是通过基因扩增来实现的，该基因扩增和肿瘤的发生有一定的关系[5]。研究认为，C-erbB-2 蛋白产物的免疫组化染色结果与基因扩增拷贝数之间呈明显的正相关，因此，通过检测口腔黏膜鳞癌组织中C-erbB-2 蛋白的表达情况，就可以对癌基因的扩增情况进行预测[6]。在Raha 等[7]研究指出，乳腺癌患者的C-erbB-2 蛋白呈高表达状态，且在转移的腋窝淋巴结中也呈高表达状态。Hung 等[8]研究发现，鼠原癌基因C-erbB-2 在扩增状态下，会导致起转膜区点突变，最后激活了C-erbB-2，因此可认为C-erbB-2 癌基因是通过以上步骤激活的，即扩增和点突变激活。本次研究中，通过对正常口腔黏膜组织中C-erbB-2 的表达情况，以及不同剂量丹参注射液联合泼尼松龙治疗OSF 前后C-erbB-2 的表达情况进行分析，发现正常口腔黏膜组织中细胞CDK2AP1的平均阳性率为（1.24±2.72）%，OSF 治疗组上皮细 胞 平 均 阳 性 率：A 组：（26.71±8.93）%；B 组：（22.41±5.91）%； C 组：（18.24±6.43）%。说明C-erbB-2在OSF 组织中的表达明显高于在正常口腔黏膜组织中的表达（P＜0.05）。C-erbB-2 在OSF 患者口腔黏膜组织中的表达情况为：A 组＞B 组＞C 组（P＜0.05）。提示C-erbB-2 在口腔黏膜组织中的表达与病理组织学分级有关，组织分化程度越低，C-erbB-2 的阳性表达越高，因此可以初步判断C-erbB-2 与口腔的恶性病变程度有相关性。临床上应用丹参注射液联合泼尼松龙治疗OSF 的效果较为明显，且在一定范围内，用药剂量越大患者的临床效果越显著。

综上所述，C-erbB-2 在口腔黏膜中的表达水平会随着口腔病变恶性程度的增高而增高，该指标对于运用精确剂量丹参注射液联合泼尼松龙治疗OSF 以及研究口腔病变恶性程度有一定意义。