分散固相萃取-气相色谱-三重四极杆串联质谱法同时测定沙拉酱中3种防腐剂

2022-12-11 08:13刘志鹏黄敏兴林继钦杨李胜王小鹏高裕锋陈其钊
中国酿造 2022年11期
关键词:山梨酸沙拉酱涡旋

刘志鹏,黄敏兴,林继钦,杨李胜,王小鹏,高裕锋,陈其钊*

(1.广东省科学院生物与医学工程研究所,广东 广州 510316;2.中国轻工业甘蔗制糖工程技术研究中心,广东 广州 510316)

沙拉酱是一种西式调味沙司,在西方人的饮食生活中必不可少,主要应用于沙拉、三明治等菜品中,在我国的消费主要集中在大、中城市,消费群体主要为年轻人,目前还有很大的市场空间[1-2]。传统沙拉酱的主要原料是植物油、鸡蛋、食醋,再加上调味料和香辛料等[3]。由于沙拉酱营养丰富、保质期短,生产厂家为保证其能有较长保质期,会加入防腐剂来抑制其中的微生物生长。其中,苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸是在沙拉酱中使用最广泛的防腐剂,但过量的食用会影响人体对维生素和钙的吸收,加重人体肝脏负担,并引起毒症反应或贫血和免疫功能下降[4-7]。GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定了上述3种防腐在沙拉酱中的最大使用量分别为1.0 g/kg、1.0 g/kg、0.5 g/kg[8]。

现阶段针对这3种防腐剂的检测方法有高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography,HPLC)[9-13]、气相色谱法(gas chromatography,GC)[14-17]、气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)法[18-19]、液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法[20-24]。目前,检测食品中这3种防腐剂的的国标方法为液相色谱法和气相色谱法[25-26]。液相色谱法和气相色谱法虽然前处理简单,仪器维护成本低,但其灵敏度相对较低,定性能力一般,容易出现假阳性情况。据相关文献报道,这3种防腐剂若要实现同时测定,需要用不同的前处理方法和不同仪器设备,实验操作起来费时费力。气相色谱-三重四极杆串联质谱(gas chromatogratriple quadrupole tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)具有高准确性、高效性、基质干扰小的特点,以及多反应监测模式检测的高灵敏度、高选择性和对色谱峰形改善等优点,目前多用于高通量农药残留的检测[27]。国内外对于使用气相色谱-三重四极杆串联质谱法测定食品中多种防腐剂的研究鲜有报道。

本研究采用分散固相萃取(dispersive solid phase extraction,DSPE)结合气相色谱-三重四极杆串联质谱(GC-MS/MS)法同时测定沙拉酱中的3种防腐剂(山梨酸、脱氢乙酸、苯甲酸),对其前处理条件的提取方式、涡旋时间、萃取溶剂进行优化,以期建立一种前处理简单,灵敏度高,抗干扰能力强,能够快速、准确地同时检测沙拉酱中山梨酸、脱氢乙酸、苯甲酸的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙拉酱:市售;山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸(纯度均>99%):广东省计量科学研究院;乙酸乙酯、正己烷、乙醚、二氯甲烷)、石油醚(均为色谱纯):上海星可高纯溶剂有限公司;七水合硫酸锌(分析纯):西陇科学股份有限公司;无水硫酸镁(分析纯):广州化学试剂厂;C18(分析纯):博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TSQ9000三重四极杆气质联用仪、Sorvall ST4 Plus高性能通用台式离心机:美国赛默飞世尔科技有限公司;ME204E电子天平:德国梅特勒-托利多集团;KQ-500DE型数控超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司;UPC-I-60L型超纯水机:成都超纯科技有限公司;MultiReax多位试管涡旋振荡器:德国Heidolph公司;WS-150D型往复式摇床:德国Wiggens公司;HP-FFAP色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm):美国Agilent Technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制

混合标准储备液的制备:分别准确称取0.025 0 g山梨酸、脱氢乙酸和苯甲酸标准物质,用乙酸乙酯溶解并定容至25 mL的容量瓶中,得到质量浓度为1 000 mg/L的混合标准储备液,置于4 ℃条件下储存。

混合标准工作溶液的制备:精密量取混合标准储备液100 μL,用乙酸乙酯定容至100 mL容量瓶中,得到质量浓度为1 mg/L的混合标准工作液。然后用乙酸乙酯进行逐级稀释,制得质量浓度分别为0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.500 mg/L的混合标准工作溶液。

1.3.2 样品的前处理

准确称取样品1 g(精确至0.000 1 g)置于50 mL离心管中,加入10 mL水、2.5 mL七水合硫酸锌溶液和4 mL氢氧化钠溶液,以转速2 000 r/min涡旋10 min后加水定容至20 mL,于4 000 r/min离心5 min,准确吸取10 mL上清液于50 mL离心管中,加入0.5 mL盐酸溶液(1∶1)酸化后,加入5 mL乙酸乙酯涡旋2 min后,于4 000 r/min离心5 min,移取2 mL上清液于装有分散固相萃取剂(C18和无水硫酸镁各200 mg)的试管中涡旋1 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜,待测。

1.3.3 气相色谱-质谱条件

气相色谱条件:HP-FFAP色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升温程序为初始温度50 ℃,保持1 min,以20 ℃/min上升到230 ℃,保持5 min;载气为高纯氦气(He)(纯度≥99.999%);碰撞气为氩气(Ar)(纯度≥99.999%);进样口温度为250 ℃;色谱柱流量为1.2 mL/min;分流比为10∶1;进样量为1 μL。

质谱条件:离子源为电子电离源(electron ionization,EI);离子源温度为300 ℃;传输线温度为280 ℃;扫描方式为选择反应监测(selected reaction monitoring,SRM)模式。3种防腐剂的保留时间、定性及定量监测离子对和碰撞能量参数见表1。

表1 3种防腐剂的保留时间、定性及定量离子对和碰撞能量Table 1 Retention time,qualitative and quantitative ion pair and collision energy of the 3 preservatives

定性定量分析:采用保留时间结合离子对丰度比进行定性分析。以目标物(3种防腐剂)的质量浓度(x)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标绘制防腐剂标准品的标准曲线,得到其线性回归方程进行定量分析。回收率计算公式如下:

1.3.4 数据处理

采用Excel 2019对数据进行处理分析,采用Origin 9.0制图。

2 结果与分析

2.1 前处理条件的优化

2.1.1 提取方式的选择

常规的提取方式有超声、涡旋和振摇。用不含防腐剂的沙拉酱作为样品,进行加标回收实验,3种提取方式均分别处理10 min,其中超声处理的功率为1 500 W,涡旋振荡器转速设为2 000 r/min,往复式摇床振摇频率为300 r/min,其余条件按照1.3.2前处理,考察3种提取方式(超声、涡旋和振摇)对回收率的影响。提取方式对回收率的影响见图1。由图1可知,整体来看,采用涡旋提取方式,山梨酸、脱氢乙酸及苯甲酸的平均回收率较高,这3种防腐剂的平均回收率分别为89.6%、95.4%、104.2%。超声与振摇的提取方式对提取效果的影响差别不大。因此,选择涡旋提取方式。

图1 提取方式对回收率的影响Fig.1 Effect of extraction method on recovery rates

2.1.2 涡旋时间的选择

采用涡旋提取方式进行提取,考察涡旋时间分别为2 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min对样品回收率的影响。涡旋时间对回收率的影响见图2。由图2可知,随着涡旋时间在2~10 min内的延长,3种防腐剂的平均回收率呈明显增加趋势;当涡旋时间>10 min后,平均回收率增加趋势较为平缓。当涡旋时间为10 min时,山梨酸、脱氢乙酸及苯甲酸的提取率分别为91.2%、98.3%、101.0%。因此,选择涡旋时间10 min。

图2 涡旋时间对回收率的影响Fig.2 Effect of vortex time on recovery rate

2.1.3 萃取溶剂的选择

选择正己烷、乙酸乙酯、石油醚、乙醚、二氯甲烷5种溶剂进行实验,在其他条件不变的前提下,考察用不同萃取溶剂对回收率的影响。萃取溶剂对平均回收率的影响见图3。由图3可知,当选择乙酸乙酯作为萃取溶剂时,3种防腐剂的平均回收率较高,提取效果最佳,山梨酸、脱氢乙酸、苯甲酸3种防腐剂的平均回收率分别为89.0%、96.2%、104.5%。因此,选择乙酸乙酯作为萃取溶剂。

图3 萃取溶剂对回收率的影响Fig.3 Effect of extraction agents on recovery rate

2.2 分散固相萃取剂的净化效果

沙拉酱是一种高脂肪食物,每100 g传统沙拉酱脂肪含量在50 g以上[2]。因此,在净化步骤中着重针对脂肪进行除杂,选择C18与无水硫酸镁各200 mg组合成分散固相萃取剂,对萃取溶液进行净化,考察其净化效果。加入分散固相萃取剂前后的样品总离子流色谱图见图4。由图4可知,加入分散固相萃取剂后,样品总离子流色谱图的背景干扰明显要小于未经净化的样品,整体基线也更加平稳。实验过程中也未发现分散固相萃取剂对3种防腐剂的回收率有影响(3种防腐剂回收率均在85%~105%范围内)。为了保护气相系统的洁净度和降低样品背景的干扰,故选择加入分散固相萃取剂作为净化步骤。

图4 加入分散固相萃取剂前(A)、后(B)的样品总离子流色谱图Fig.4 Total ion chromatogram of the samples of before (A) and after (B) adding dispersant

2.3 方法学考察

2.3.1 方法的线性回归方程、检出限与定量限

3种防腐剂的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限见表2。由表2可知,3种防腐剂在质量浓度0.001~0.100mg/L范围内呈现良好的线性关系,相关系数R2≥0.999。在称样量为1.00 g时进行低浓度加标回收实验,以目标峰高等于3倍基线噪音为检出限,目标峰等于10倍基线噪音为定量限进行计算,方法的检出限为0.002~0.010 mg/kg;方法的定量限为0.006~0.030 mg/kg。3种防腐剂的检出限与定量限均远低于国标方法,说明本方法具有一定优越性。

表2 3种防腐剂的线性回归方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 3 preservatives

2.3.2 加标回收率和精密度试验

以不含防腐剂的沙拉酱作为空白样品进行加标回收率试验,分别准确加入0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、0.50 mg/kg 3个水平浓度的3种防腐剂混合标准溶液,按照方法1.3.2进行前处理,每个添加水平做6次重复试验,计算其加标回收率、精密度试验结果相对标准偏差(relative standard de viation,RSD),结果见表3。由表3可知,空白沙拉酱中3种防腐剂不同加标水平下的平均回收率和RSD范围分别为88.6%~104.8%、2.0%~5.3%,符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》要求。结果表明,本方法具有良好的准确度和精密度,能满足日常检测的要求。

表3 3种防腐剂的加标回收率及精密度试验结果Table 3 Results of spiked recovery and precision tests of 3 preservatives

2.4 实际样品检测中该方法与国标方法的比较

将该方法运用到从市场随机购买回来的38份样品中进行检测。结合GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》判定,样品的实际检出情况为:山梨酸检出率为63.1%;脱氢乙酸的检出率为8.8%;苯甲酸检出率为21.1%,没有不合格样品。选取3种防腐剂均为阳性的一份样品,采用本方法与国标方法进行比较,试验结果见表4。由表4可知,采用本方法检测的山梨酸、脱氢乙酸、苯甲酸的实测值分别为0.135 g/kg、0.127 g/kg、0.158 g/kg,采用国标方法检测的这3种防腐剂的实测值分别为0.129 g/kg、0.122 g/kg、0.147 g/kg,说明本方法与国标方法的试验结果无明显差异,采用本方法检测的这3种防腐剂的RSD分别为3.4%、2.9%、3.7%,国标方法检测的这3种防腐剂的RSD分别为4.1%、2.8%、4.5%,该方法的RSD在一定程度上优于国标方法。该方法的检测效率具有一定优势,仅需要一次简单的前处理,一台仪器,便能同时准确地对3种防腐剂进行定量。

表4 本方法与国标方法检测结果的比较(n=6)Table 4 Comparison of determination results of the method with national standard method (n=6)

3 结论

本研究采用分散固相萃取结合气相色谱-三重四极杆质谱法对沙拉酱中的山梨酸、脱氢乙酸和苯甲酸进行测定。针对沙拉酱是一种高脂肪食物,最佳前处理条件为加入10 mL水、2.5 mL硫酸锌溶液和4 mL氢氧化钠溶液涡旋处理10 min后加水定容至20 mL,于4 000 r/min离心5 min,准确吸取10 mL上清液于50 mL离心管中,加入0.5 mL盐酸溶液(1∶1)酸化,加入乙酸乙酯涡旋2 min后4 000 r/min离心5 min,移取2 mL上清液于装有分散固相萃取剂(C18和无水硫酸镁各200 mg)的试管中涡旋1 min,取上清液过0.22 μm微孔滤膜,待测。在此优化前处理条件下,3种防腐剂在质量浓度0.001~0.100 mg/L线性范围内呈良好的线性关系,相关系数R2均>0.999,平均加标回收率为88.6%~104.8%,精密度试验结果的相对标准偏差(RSD)为2.0%~5.3%,方法检出限为0.002~0.010 mg/kg,定量限为0.006~0.030 mg/kg。该方法对比国标方法,灵敏度更高、定性准确、所需仪器更单一、抗干扰能力更强,可以满足沙拉酱中多种防腐剂的检测需求。

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