曲霉聚合酶链反应的技术推荐、临床应用和纳入原则更新
——欧洲癌症研究和治疗组织/真菌研究组教育和研究共同体（EORTC/MSGERC）第二次修订

2019年欧洲癌症研究和治疗组织/真菌研究组教育和研究共同体（EORTC/MSGERC）侵袭性真菌病定义共识更新，将血液和支气管肺泡灌洗液（BALF）的曲霉聚合酶链反应（PCR）纳入侵袭性曲霉病（IA）临床诊断的真菌学标准。取得该显著进步的基础源于以下方面：欧洲曲霉PCR方案（EAPCRI），现在被称为真菌PCR方案（FPCRI）极大促进了曲霉PCR方法学的标准化；商品化试剂的可及性；各种荟萃分析和随机对照临床研究（研究方案中包含PCR技术）；以及检测性能的第三方评价。

当考虑某一检测方法是否适用于临床时，必须考虑其技术的稳定性和适用性、分析和临床性能以及临床实用性。检测频率、样本类型和结果解释都会受到检测目的（筛查与诊断）的影响，并因检测目的的变化而变化。在将一项检测方法纳入到EORTC/MSGERC定义的过程中，方法特异性最为重要，因为将患者纳入新疗法的临床试验或评估新试验的性能时，诊断的准确性至关 重要。

本文总结了将曲霉PCR纳入到最新的EORTC/MSGERC定义的依据，并描述了其最新进展、临床需求和发展潜能。

1 技术方面

1.1 核酸提取

多年来，由于商业检测的缺乏，方法学标准化受限，阻碍了曲霉PCR纳入到EORTC/MSGERC定义的进程。EAPCRI/FPCRI的研究表明，曲霉检测分子方法的性能有赖于核酸（NA）提取，以提供足够高质量的DNA，并尽可能去除抑制化合物。针对全血、血清和血浆标本的研究显示合适的标本可为≥3 mL EDTA全血或≥0.5 mL血清/血浆且核酸洗脱体积＜100 µL。从血清/血浆标本中检测循环游离DNA，在方法学上是非常简单的，在大多数分子诊断实验室中，都是使用核酸全自动提取平台进行。与全血相比，血清中提取核酸特异度更高，但灵敏度较低。血浆样本的灵敏度优于血清，与全血相当，但特异度较低。若考虑呼吸道及其他送检样本中存在真菌，则需要机械破碎真菌细胞，从而保证有效的核酸提取。由于宿主免疫应答或抗真菌治疗的作用，呼吸道中可出现游离的真菌DNA，将BALF样本离心后，使用核酸提取仪就可得到病原DNA和游离DNA片段。考虑到某些BALF标本比较黏稠，在核酸提取之前，样本需要进行液化处理。

1.2 PCR扩增

PCR扩增不是曲霉PCR成功的关键，使用不同的方法检测相同的核酸浓度时，其检测速度基本一致。但扩增多拷贝基因可提高PCR的分析灵敏度，如核糖体RNA基因簇[18S/28S rRNA和内转录间隔区（ITS）]。由于IA最常由烟曲霉引起，大多数检测方法优先检测烟曲霉。然而，其他菌种也会引起曲霉病，因此曲霉属检测更有利，但可能存在其他菌属（如青霉属）的交叉污染。目前的曲霉PCR检测试剂更适合检测烟曲霉；PCR可在属水平上针对rRNA基因进行检测，这可提高非烟曲霉种的检测性能。

实时定量PCR可在种水平上进行快速鉴定，并大大降低污染的可能性。其定量循环（quantification cycle, Cq） 与真菌载量成比例，可很好地解释阳性结果。通常情况下，在检测血液样本时若Cq值＞35个循环，结果重复性不佳。进行复孔PCR扩增可提高低含量核酸样本的检测灵敏度。室内质控也至关重要。解释低载量结果是否具有临床意义是非常复杂的，可能是因为样本与感染部位没有直接联系、病情不严重或没有侵犯到血管等。如果Cq值大于35个循环是由于临床和实验室环境的污染而出现的假阳性，应使用阴性对照监测环节污染。商品化试剂盒通常提供阳性和阴性质控品，可按照试剂盒规定方法进行质控。

Cq阈值的设置至关重要。设置低的阈值可提高灵敏度，但会降低特异度。虽然从临床早期诊断与治疗需求的角度，不漏诊真阳性病例更为重要，然而，EORTC/MSGERC指南的目的是明确分类标准，使临床实践具有高度确定性，因此对特异度要求高。最近关于血液曲霉PCR检测文献和荟萃分析的Cochrane系统综述采纳了新的EORTC/MSGERC标准（29项研究，34个数据集，4 718例患者，平均IA患病率为16.3%），综述显示，2个连续阳性的总灵敏度/总特异度为60%/95%，证实了目前的纳入标准为2个阳性PCR结果。

BALF检测通常用于诊断已出现临床症状的高危患者，因此，这类检测的特异性至关重要。荟萃分析说明，BALF曲霉PCR检测的特异度高（94%～95%），阳性似然比高（＞12），适合确诊感染，并被纳入到当前的定义中。实时PCR阳性与Cq值相关，Cq值与样本中的真菌载量成比例；这有助于设定阈值，以区分呼吸道样本是感染、定植或污染。

商品化曲霉PCR检测提供了质量保证和技术一致性，包括提供质控样本，便于更多不具备真菌检测标准设施的实验室采用，但在性能方面并未表现出明显的优势。商业检测不推荐特定的核酸提取方法。标准化的方法是将商业检测与FPCRI建议的核酸提取方法相结合，以便于在各检测中心推广，实现方法学的统一。这种方法的一致性以及曲霉PCR检测的外部质控（分子诊断学的质量控制）保证了检测的稳定运行。目前正在制定的曲霉PCR国际标准中，提出了使用国际曲霉DNA校准仪，从而实现多个检测平台使用同一质控品。综上所述，理想情况下，曲霉PCR检测应仅使用实时PCR平台进行。

2 临床应用和性能

2.1 筛查与诊断

临床医师申请曲霉PCR检测主要是为了诊断临床诊断IA患者，或者筛查有发病风险的个体，以便早期诊断。筛查最适用于中到高风险的IA患者（如急性白血病或移植受者），因为患病率决定了检测的效果。

荟萃分析综述显示，使用曲霉PCR筛查血液样本的灵敏度为84%～88%，特异度为75%～76%。在最新的Cochrane综述中，血液曲霉PCR检测的统计数据与其类似（灵敏度为79%；特异度为80%）。

抗曲霉预防治疗显著降低了IA筛查阳性的概率，也导致了其特异度显著降低（79%～64%），而灵敏度未显著增加（75%～82%）。这与抗真菌治疗对半乳甘露聚糖酶免疫分析（GM-EIA）的影响相矛盾，可能是因为预防法可以防止最初的感染加重；而抗真菌剂靶向细胞壁或细胞膜，导致核酸的释放，造成曲霉DNA的持续存在甚至增加。预防治疗的患者采取BALF曲霉PCR检测，可实现突破性诊断。

在临床诊断IA患者时，感染部位的样本比血液样本更有意义。在一项多中心回顾性分析中，BALF与血液样本同时进行曲霉PCR检测，BALF的PCR敏感度（63%）显著高于血液样本（8%）。此外，尽管75%的样本是在抗真菌治疗期间采集的，但这并没有对BALF的检测结果产生影响。目前尚无直接比较筛查和诊断PCR方法性能的研究。然而，在同时使用PCR和GM-EIA定期筛查的IA病例中，73%的患者血液样本的阳性结果平均比支气管镜检查结果提前了11 d，所以前者更有利于早期诊断。

BALF曲霉PCR检测的荟萃分析性能与GMEIA相当，灵敏度和特异度相似，范围分别为76.8%～79.65%和93.7%～94.5%。曲霉PCR结合抗原检测，性能最佳。在一项BALF检测的研究中，PCR和GM（I＞1.0）相结合的灵敏度为100%，特异度为98%。商业Pathonostics AsperGenius检测验证了此方法：PCR与GM（I＞1.0）结合，灵敏度为96%，特异度为100%。这些发现为商业PCR和抗原检测的联合应用提供了临床支持。BALF抗原/PCR检测荟萃分析的灵敏度为84%，特异度为94%。BALF的联合检测使灵敏度增加了5%～9%，特异度也足以诊断IA（阳性似然 比=14）。各种随机对照试验和前瞻性研究说明，血液样本抗原/PCR联合检测有助于诊断IA。一项荟萃分析表明，如果两项检测均为阴性，灵敏度（99%）足以排除IA，而两项检测均为阳性时诊断特异度为98%。血液和BALF联合检测，特异度更高，当两种检测结果均为阳性时，可增强临床诊断IA患者的信心。相反，如果两种检测结果均为阴性，就可排除疾病。这对于抗真菌管理策略的成功应用至关重要。

最新的欧洲临床微生物与感染性疾病学会/欧洲医学真菌学联盟/欧洲呼吸学会（ESCMID/ECMM/ERS）曲霉病管理指南在一定程度上支持对血液、BALF和脑脊液（CSF）样本进行PCR检测，进而诊断IA。BALFGM-EIA和PCR联合检测的应用，使该建议更具说服力。2016年美国传染病学会曲霉病指南建议，PCR应在个体基础上进行，但也要结合其他检测和临床情况。由于实时曲霉PCR检测的发展，在治疗过程中可使用该检测作为评价预后的指标。然而，检测血液样本时，Cq值经常延迟，患者通常在接受治疗后立即转阴，故只作为定性检测。而BALF的PCR检测阳性通常与Cq值有关，可用于疗效监测，但侵入性取样的方式不适合进行预后评估。

2.2 在非中性粒细胞减少症患者中的应用

大多数关于曲霉生物标志物分析评估的数据是基于对中性粒细胞减少症患者和造血干细胞移植（HSCT）患者的检测。对非中性粒细胞减少症患者进行的生物标志物检测评估有限，但需求日益增长，因为重症监护病房（ICU）中出现IA的频率明显增加，包括2019冠状病毒病（COVID-19）患者。由于非中性粒细胞减少症的IA患者很少侵犯血管，频繁筛查血液样本效果有限。非中性粒细胞减少症患者曲霉感染局限于呼吸道（如流感感染后的曲霉气管支气管炎），临床表现为炎症反应；而中性粒细胞减少症患者感染曲霉表现为组织梗死，因此目前首选PCR检测进行诊断。然而，考虑到某些ICU中IA的发生率越来越高（流感后患者为19%，COVID-19后患者为33%），优先选用筛查方法，即采用商业曲霉PCR检测ICU患者的BALF样本，其灵敏度为100%，特异度为99%～100%。有研究发现，在ICU患者中，对血液病和危重患者的BALF样本进行Pathonostics AsperGenius检测，其性能是相同的，灵敏度为80%，特异度为91%。

2.3 在儿科患者中的应用

对儿童曲霉PCR进行性能评估的研究有限，尤其是对新生儿。现有研究主要针对高危儿科患者（如白血病、移植和慢性肉芽肿性疾病）曲霉PCR进行性能评估。由于一些研究囊括了确诊/临床诊断IA患者、使用了泛真菌PCR技术或病例分类标准不符合EORTC/MSGERC定义，总体临床性能不稳定，数据分析相当复杂。对于研究数据进行分析，总体灵敏度为82.3%，特异度为72.8%，这与最新的曲霉Cochrane综述结果相当，说明曲霉PCR的诊断性能在成人和儿童之间没有显著差异。

由于研究数量有限，在儿科IA患者诊断和管理方面，近期没有与PCR检测相关的建议。对成人和儿童来说，曲霉PCR的性能相似。

3 发展前景和需求

由于不同的曲霉种类具有不同的抗真菌药物敏感性，因此采用分子方法鉴别出不同的菌种具有意义。当前主要的PCR方法很少对非烟曲霉（如土曲霉）进行检测。虽然在烟曲霉复合群中可能鉴别出非烟曲霉种，如Aspergillus lentulus，但大多数其他菌种不能检测。最近几种商品化检测法（例 如Fungiplex Aspergillus，Bruker UK Limited，Glasgow，UK和AsperGenius，Pathonostics，Maastricht，Netherlands）可用于区分土曲霉和其他菌种。通过熔解曲线分析，AsperGenius检测可以在烟曲霉复合群中鉴别出A.lentulus和Aspergillus felis，然而该检测仅适用于从培养物中提取的DNA。在临床标本的菌种鉴定方面，尚需更多的研究。

传统药敏试验耗时长且可能因菌种生长不良而无法进行，PCR技术克服了传统药敏试验的局限性，可用于鉴定耐药真菌。烟曲霉单核苷酸多态性（SNP）或串联重复序列与耐三唑类药物相关，针对其最常见突变（TR34/L98H和TR46/Y121F/T289A）的 商 品 化 检 测（Mycogenie, Ademtech, Pessac, France；Pathonostics AsperGenius） 现 已 问世。另一种检测方法是在治疗过程中使用分子方法检测耐药性。然而，由于血液中的核酸半衰期很短，BALF中的核酸不一定代表活动性感染，其应用受到了限制。

由于基于PCR的DNA测序复杂费时，实时PCR凭借着快速的优势逐步替代了PCR测序，但可检测的突变范围缩小了。最新的实时PCR可检测7种cyp51A突变，但尚未投入临床使用。BALF样本AsperGenius检测的多中心评估显示，突变的存在与治疗失败（75%对27%，P=0.01）和6周死亡率增加（50% 对19%，P=0.07）具有显著相关性。AsperGenius检测与直接从样本中鉴定突变的PCR测序相比，PCR测序在性能上仅略显优势。快速焦磷酸测序方法能检测越来越多的突变，并已直接应用于临床样本。虽然可以直接检测血液样本来鉴定突变，但核酸量过低，不利于靶基因的成功扩增。

随着二代测序（NGS）的迅猛发展，将来有望应用NGS技术直接从临床标本中检测和鉴定真菌，在暴发期间实现菌种水平（甚至在真菌生物群内）的鉴定，并确定抗真菌药物敏感性和基因型。目前，在常规使用之前，仍有几个限制因素，包括选定最佳的基因片段进行物种鉴定 （例如，ITS 1/2区域仅能区分75%的真菌种），同时保持所需分析的灵敏度（多拷贝与单拷贝基因），优化从采样到DNA提取、PCR扩增的整体检测过程，以及解决NGS生物信息学工具和仪器匮乏的问题。鉴于使用分子方法研究呼吸道真菌菌群复杂性，由于某一共生/定植菌种/属的大量存在，会干扰具有临床意义的真菌的检出，NGS方法还需进一步改进以避免漏诊。数字液滴曲霉PCR可定量检测真菌，且灵敏度更高，这一技术的进步令人振奋。

4 结论

现已收集了大量曲霉PCR检测的数据，以支持其应用于临床和科研。随着分子技术的不断进步及临床需求的亟待解决，分子技术的进一步发展将改善其在临床筛查、诊断和治疗方案选择中的应用。