富硒培养对羊肚菌母种菌丝生长的影响

朱金霞 冯 锐 任怡莲

（1.宁夏农林科学院农业生物技术研究中心，宁夏农业生物技术重点实验室，宁夏 银川 750002；2.宁夏农林科学院农业经济与信息技术研究所，宁夏 银川 750002；3.宁夏农林科学院，宁夏 银川 750002）

羊肚菌隶属子囊菌门、盘菌纲、盘菌目、羊肚菌科、羊肚菌属（Morchella），因其菌盖呈褶皱网状似羊肚而得名，在民间也被称为阳雀菌、狼肚菌、麻子菌、天狼肚、包谷菌儿、编笠菌、鸡蛋花等[1]。羊肚菌味道鲜美，含有铁、锌等矿质元素，24.5%蛋白质，19 种氨基酸[2]，还含有羊肚菌酸、多糖、甾醇等特征成分[3]，具有“菌中之王”的美誉，广受欧洲、美洲、东亚、东南亚一些国家欢迎。

据《本草纲目》记载，羊肚菌性平，味甘寒，有益肠胃、助消化、化痰理气、补肾壮阳、补脑提神等功效[4]。现代医学研究表明，羊肚菌能降血脂、调节免疫、抗疲劳、抗病毒、抗菌、抑制肿瘤和减轻放化疗引起的毒副作用等[2,3]。随着社会经济的发展和人们对羊肚菌营养和保健价值认知的加深，对于羊肚菌的需求也会越来越大，生产高品质的羊肚菌既符合当代消费者的需求，也是羊肚菌产业发展的重要契机。

硒是人类生命活动必需的微量元素之一，人体适量摄入硒元素能预防细胞癌变、减缓衰老、增强免疫力和解毒排毒等，严重缺硒会诱发大骨节病、克山病、呆小症等病症[5]。现代医学表明，威胁人类健康和生命的疾病中有四十多种与缺硒有关[6]。由于人体不能自身合成硒，所以硒的营养水平主要来源于日常饮食，而土壤或栽培料又是植物硒的主要来源[7]。

中国是全球严重缺硒的地区之一，低硒地区占全国的72%，部分地区严重缺硒[5]，外源添加硒元素是提高作物硒含量的重要途径。自然界中硒主要以有机硒和无机硒的形态存在，人类需要的是有机硒[5]，而纳米硒粒径较小，比表面积大，表面活性高，易被肠道吸收，具有较高的生物利用率。此外，纳米硒急性毒性显著低于亚硒酸钠，比常用的硒化物的安全剂量范围更广[8]。

食用菌是良好的硒生物转化载体，能够将环境中的无机硒转化为安全高效的有机硒[9]，开展食用菌富硒栽培，能够将食用菌和硒元素的功能有机融合，研制富硒的食品或药品，对于食品、保健和医药领域都具有重要意义[10,11]。而食药用菌中所积累的微量元素含量与生长环境类型、食药用菌种类、元素类型有关，生长环境中过量的硒元素会阻碍菌丝生长和子实体形成[12,13]。

本研究在总结前人工作的基础上，以改良PDA培养基为基础培养基（对照），比较培养基不同纳米硒添加量对羊肚菌母种菌丝生长的影响，以筛选出羊肚菌母种菌丝富硒培养最适的纳米硒添加量，为羊肚菌母种菌丝的富硒驯化培养和菌种制作提供理论基础和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

（1）菌种。供试羊肚菌品种为六妹羊肚菌（Morchella sextelata），由宁夏农林科学院农业生物技术研究中心微生物与酶工程研究室经子实体组织分离、培养和纯化后获得，4 ℃保存于试管中。

（2）羊肚菌母种培养基制备。基础培养基为改良PDA 培养基（T0），制作方法：马铃薯（去皮、切条）250 g，加蒸馏水约1 000 mL 加热至沸腾，小火煮沸15 min，4 层纱布过滤。滤液中添加葡萄糖30.0 g、KH2PO42.5 g、MgSO42.0 g、蛋白胨2.0 g、琼脂15.0 g，用蒸馏水定容至1 000 mL，分装。富硒母种培养基制备方法：在分装后的基础培养基中加入纳米硒，121 ℃灭菌30 min 后制作平板。纳米硒添加量设置7 个水平，分别为0.052、0.104、0.208、0.416、0.832、1.664 和3.328 mg/L，编号T1～T7。每个水平重复6 次。

1.2 菌种活化方法

在基础培养基平板中央接入羊肚菌试管种，在12±1 ℃条件下暗培养5 天，备用。

1.3 菌落长势调查方法

在无菌条件下，活化的羊肚菌平板种打孔制成直径10.0 mm 菌饼，分别接种至不同纳米硒添加量的平板中央，在12±1 ℃下暗培养。接种后第3 天开始用游标卡尺测量菌落直径（mm），至培养第10 天时结束实验。

1.4 数据处理

利用Excel 软件进行数据处理分析。

2 结果与分析

2.1 不同纳米硒添加量的羊肚菌菌落直径

由图1 可知，培养基中纳米硒添加量对羊肚菌菌落直径影响显著，菌落直径随培养基中纳米硒添加量的增加呈先增大后减小的趋势。纳米硒添加量为0.104 mg/L（T2）时，菌落直径最大。在接种后第3～6 天，T2 处理菌落直径分别可达35.1 mm、48.6 mm、62.7 mm 和77.2 mm，比未添加纳米硒的对照T0 大23.17%、19.93%、18.99%和15.16%。

图1 不同处理的羊肚菌菌落直径变化

培养基中纳米硒添加量为0.416 mg/L（T4）时，菌落直径与T0（CK）比较差异不显著（P>0.05）。随着培养基中纳米硒添加量的增大，当硒添加量≥0.832 mg/L（T5）时，菌落直径显著小于对照（P<0.05），往后硒添加量越大，菌落直径越小。

由表1 可知，母种培养基中纳米硒添加量对羊肚菌菌落直径日均增长量具有显著影响。菌落直径日均增长量，除T0（CK）处理随培养时间增加呈先增大后减小的趋势外，其他处理均呈增大趋势。各处理菌落直径日均增量最大值出现时间，T0（CK）为第4 天，而添加纳米硒的其他处理均为第6 天。

表1 不同处理羊肚菌菌落直径日平均增长量（单位：mm）

2.2 不同处理羊肚菌菌丝体的形态特征

由图2 可看出，培养基中纳米硒添加量为0～3.328 mg/L 时（T0～T7），羊肚菌菌丝均能生长，但各处理间形态差异明显。在接种后第10 天，T0～T5 处理的菌丝均已长满平板，以T2 处理的菌丝体长势最旺，密度最大。T7 处理虽然菌丝体密度大，但长速慢、长势弱，可见，培养基中硒添加量过大，对羊肚菌菌丝体生长具有显著抑制作用。

图2 不同富硒处理羊肚菌菌丝体形态特征（第10 天）

3 讨论与结论

天然食用菌中硒含量普遍偏低[14]，食用菌具有一定的富硒功能，外源添加硒元素是提高食用菌硒含量的重要方法，目前已经培育出的富硒食用菌种类有灵芝、金针菇、平菇、香菇和猴头菌等[9,10]。羊肚菌具有较强的富硒能力，能通过生物吸附及细胞内生化作用吸收无机硒，并与大分子活性物质结合，最终以硒蛋白或硒多糖等形式存在[15]。羊肚菌菌丝体富硒培养相比于常规培养，其菌丝体多糖具有更高的体外抗氧化作用[16]，且菌丝体兼具硒的生物活性，价值更高。

随着富硒食用菌优势的逐渐显现，其价值渐被认可，随着富硒食用菌优势的逐渐显现，其价值渐被认可，相关研究增多。如有学者研究表明，低浓度的亚硒酸钠对灵芝菌丝具有促进作用，灵芝斜面培养基培养时最佳亚硒酸钠浓度为0.05 g/L[17]；白灵菇母种培养基和培养料中添加40～80 mg/kg 亚硒酸钠能提高菌种质量，促进菌丝生长，提高子实体富硒能力和产量[18]。

现阶段关于富硒羊肚菌的研究主要集中在菌丝体发酵培养阶段，且菌株间存在较大差异。李娟[19]报道泰山羊肚菌液体培养最适硒离子浓度为200 mg/kg，此时菌丝体有机硒含量比对照提高145 倍。冮洁等[20]报道，羊肚菌液体培养的适宜亚硒酸钠浓度为10 mg/L。张跃非[16]研究发现，亚硒酸钠浓度为9 g/L 时羊肚菌菌丝体生物量最高，超过11 g/L时菌丝体生物量有所下降，但在5 g/L 时，菌丝体富硒率高于生物量最高时的富硒率。

本研究结果表明，母种培养基中，纳米硒添加量低于0.416 mg/L 时，六妹羊肚菌菌丝能够正常生长；添加量≥0.832 mg/L 时，则呈现出显著的抑制作用；添加量为0.104 mg/L 时，菌丝生长快而旺盛，菌丝体密度大，是六妹羊肚菌母种培养基的最佳纳米硒添加量。