通脑益智颗粒联合粪菌移植对血管性认知障碍大鼠学习记忆能力和肠道菌群的影响

刘怀峻,颜习武,张秋池,孟 婷,刘金凤,常 诚

(1. 南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210046；2. 南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029)

血管性认知障碍是脑血管病变导致的卒中或亚临床脑血管病引起的记忆、认知、行为等脑区低灌注综合征，其发病机制复杂，目前各国指南无一致推荐治疗药物[1-2]。通脑益智颗粒是江苏省中医院院内制剂，具有通瘀开窍、化痰和络、补益脾肾的功效，临床用于治疗血管性认知障碍患者取得较好的临床疗效[3]，但其具体作用机制尚不明确。近年来研究认为，肠道菌群紊乱与认知障碍等多种急慢性疾病密切相关[4-5]，且肠道菌群与中医药治疗存在相互影响的关系，两者在正常生理条件下互相配合发挥作用，而病理状态下的肠道菌群会减弱中药的疗效[6-8]。随着“脑肠轴”理论的完善[9]，菌群移植近年来成为治疗神经系统疾病的新方法，为直接改变肠道菌群进而治疗疾病提供了新思路[10-11]。本实验通过建立血管性认知障碍大鼠模型，探讨了通脑益智颗粒联合粪菌移植技术治疗血管性认知障碍的可能机制，以为临床应用提供依据。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级雄性SD大鼠70只，8周龄左右，体重250～350 g，购自浙江省医学院动物中心，许可证编号：SCXK(浙)2019-0002。饲养于南京中医药大学附属医院SPF级动物实验中心，实验室环境保持温度和相对湿度分别在20～25 ℃和40%～60%，12 h光照/黑暗循环，适应环境并自由饮食1周。本实验经南京中医药大学附属医院实验动物伦理委员会审批通过(2020DW-08-02)。

1.2药物 通脑益智颗粒：方由制大黄6 g、广郁金10 g、炙黄芪10 g、川芎6 g、石菖蒲12 g、枸杞10 g、水蛭3 g、益智仁10 g、仙鹤草15 g组成，经由南京中医药大学附属医院药学部批准下发，颗粒剂由江阴天江药业生产，以10倍超纯水溶解，旋转蒸发至所需浓度，4 ℃冰箱保存备用。盐酸多奈哌齐：卫材(中国)药业有限公司，国药准字H20070181，取10 mg盐酸多奈哌齐，加蒸馏水按照设定的给药浓度配制成混悬液，4 ℃冰箱保存备用。粪菌胶囊：南京希尔寿生物科技有限公司生产并提供，每粒内含约0.1 g粪便剂量粪菌，由正常健康大鼠新鲜粪便按照标准制作流程，多次过滤，冷冻离心，沉淀取出后灌装胶囊，制成后-80 ℃冰箱保存备用。

1.3试剂和仪器 NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建库试剂盒，批号：NOVA-5144-03，美国Bioo Scientific公司；OMEGA-soil DNA Kit抽提，批号：R6842-02，美国Omega Bio-Tek公司；FastPfu Polymerase扩增，批号：AP221-01，北京全式生物技术有限公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit纯化，批号：AP-GX-500G，美国Axygen公司；PCR仪，ABI GeneAmp®9700型；SLY-Morris水迷宫系统，南京医科大学动物实验基地。

1.4实验方法 取10只大鼠作为假手术组，其余60只大鼠采取目前公认的双侧颈动脉结扎方法建立血管性认知障碍模型。造模方法：手术前大鼠禁食12 h，不禁水，腹腔注射3%戊巴比妥钠1.5 mL/kg麻醉后，将大鼠仰卧固定在手术台上，取颈正中切口，钝性剥离结缔组织和颈前肌群，分离双侧颈总动脉，假手术组不结扎，其余大鼠分别结扎颈总动脉近端和远端，并从中间剪断，以永久阻断血流。伤口洒适量青霉素粉后缝合。手术过程中，保持大鼠自主呼吸，并保持肛温(37±0.5)℃。手术21 d后,使用Morris水迷宫实验筛选血管性认知障碍大鼠：以假手术组大鼠定位航行检测的逃避潜伏期为参考值，造模完成的大鼠2次定位航行实验的逃避潜伏期平均值与假手术组大鼠参考值的比值高于1.2即认为血管性认知障碍模型造模成功。将造模成功的50只大鼠结合体重按照分层随机的方法分为模型组、多奈哌齐组、通脑益智组、粪菌移植组、通脑益智联合粪菌移植组，每组10只。为减少大鼠初始菌群对最终实验结果以及药物的影响，同时减少混杂因素，在正式干预前对所有血管性认知障碍大鼠肠道菌群进行抗生素均一化处理，即给予硫酸新霉素和硫酸链霉素按照1∶1的比例配制成的混合溶液200 mg/kg连续灌胃6 d，假手术组大鼠同期给予等量的生理盐水灌胃,均早晚各1次。之后假手术组和模型组均给予生理盐水1 mL/100 g灌胃，多奈哌齐组给予多奈哌齐1 mg/(kg·d)灌胃，通脑益智组给予通脑益智颗粒方提取液9 g/(kg·d)灌胃(相当于临床成人剂量的等效剂量)，粪菌移植组每天给予2粒粪菌胶囊灌胃；通脑益智联合粪菌移植组给予通脑益智颗粒方提取液及粪菌胶囊灌胃，各组均连续灌胃28 d。

1.5检测指标及方法

1.5.1大鼠的学习和记忆能力 实验结束后进行Morris水迷宫实验。实验时把水池分成4个象限，将平台放置在第Ⅱ象限的中心。在水池中注入(22±2)℃的清水，水位高度超越平台1～2 cm,并使用黑色墨水把水染黑以增强视频的对比度。①定位航行实验：分别从平台所在象限之外的不同入水点将大鼠放入水池，记录大鼠找到平台所需时间即逃避潜伏期。若大鼠在60 s结束时仍未找到平台，则逃避潜伏期记为60 s，并将老鼠带领上平台，停留10 s。每只大鼠每天进行3次实验，每次间隔15～20 min，连续训练4 d。②空间探索实验：在定位航行实验完成后第2天，撤走原有平台，并将大鼠从最远离原平台位置放入水池，摄像自动记录60 s内大鼠穿过原平台区域的次数及在原平台区域停留时间和平台所在象限停留时间。

1.5.2肠道菌群结构分析 随机取每组7只大鼠的粪便，采用 16S rDNA生物信息技术完成肠道菌群结构检测分析(委托深圳微科盟生物科技有限公司检测)。根据E.Z.N.A.®soil试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)说明书进行总DNA抽提，采用NanoDrop2000检测DNA浓度和纯度，采用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物对V3～V4可变区进行PCR扩增。使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测、QuantiFluorTM-ST定量后，根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2*300的文库。参照文献[12-14],利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序,之后基于OTU聚类分析结果进行α及β多样性指数分析，并基于分类学信息在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。

2 结 果

2.1各组大鼠逃避潜伏期比较 定位航行实验第4天时，模型组大鼠的逃避潜伏期较假手术组明显延长(P<0.05)，多奈哌齐组、通脑益智组、粪菌移植组和通脑益智联合粪菌移植组均较模型组明显缩短(P均<0.05)，且脑益智联合粪菌移植组明显短于多奈哌齐组(P<0.05)。见表1。

表1 假手术组和血管性认知障碍各组大鼠定位航行实验逃避潜伏期比较

2.2各组大鼠空间探索能力比较 与假手术组比较，模型组大鼠穿越平台次数明显减少(P<0.05)，平台目标区域停留时间和平台所在象限停留时间均明显缩短(P均<0.05)；与模型组比较，多奈哌齐组、通脑益智组、粪菌移植组和通脑益智联合粪菌移植组大鼠穿越平台次数均明显增加(P均<0.05)，通脑益智联合粪菌移植组大鼠平台目标区域停留时间、平台所在象限停留时间和通脑益智组平台所在象限停留时间均明显延长(P均<0.05)；通脑益智联合粪菌移植组大鼠穿越平台次数明显多于多奈哌齐组(P<0.05)，平台目标区域停留时间、平台所在象限停留时间均明显长于多奈哌齐组(P均<0.05)。见表2。

表2 假手术组和血管性认知障碍各组大鼠空间探索能力比较

2.3各组大鼠肠道菌群结构α多样性分析比较 物种稀释曲线显示实验样本量充分，见图1。模型组、多奈哌齐组、通脑益智组大鼠的OTU指数、Chaol指数和模型组Simpson指数均明显低于假手术组(P均<0.05)，通脑益智联合粪菌移植组大鼠的OTU指数、Simpson指数、Chaol指数均明显高于模型组(P均<0.05)，各组间Shannon指数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 假手术组和血管性认知障碍各组大鼠肠道菌群α多样性分析指数比较

2.4各组大鼠肠道菌群门水平相对丰度比较 与假手术组比较，模型组大鼠肠道菌群中厚壁菌门相对丰度和蓝藻菌门相对丰度明显升高(P均<0.05)，拟杆菌门相对丰度、拟杆菌门/厚壁菌门比值和放线菌门相对丰度均明显下降(P均<0.05)。与模型组比较，通脑益智联合粪菌移植组大鼠肠道菌群中厚壁菌门相对丰度和蓝藻菌门相对丰度均明显下降(P均<0.05)，拟杆菌门相对丰度、拟杆菌门/厚壁菌门比值和放线菌门相对丰度均明显升高(P均<0.05)。各组间变形菌门相对丰度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

图1 根据假手术组和血管性认知障碍各组大鼠肠道菌群测序样本的结果绘制而成的物种稀释曲线

表4 假手术组和血管性认知障碍各组大鼠差异肠道菌群在门分类水平上相对丰度比较

2.5各组大鼠肠道菌群属水平丰度聚类分析 根据大鼠肠道菌群测序结果，选取丰度前20的菌属绘制成热图(见图 2)，假手术组、通脑益智组、粪菌移植组和通脑益智联合粪菌移植组所在分支距离近，聚类明显，表明这4组间的微生物群落构成在属水平上最为接近；这4组所在分支与模型组和多奈哌齐组距离远，无明显共同聚类，表明与模型组和多奈哌齐组组间菌属构成差异较大。

横向为每组样品信息；纵向为物种注释信息图2 假手术组和血管性认知障碍各组大鼠肠道菌群在属分类水平上物种丰度聚类图

2.6各组大鼠肠道微生物菌落构成情况 根据各组样本结果进行PCoA分析(见图3)，结果示模型组及多奈哌齐组间的距离较近，2组菌群结构相似。与假手术组、通脑益智组、粪菌移植组和通脑益智联合粪菌移植组菌群结构与模型组及多奈哌齐组比较具有明显差异，这4组之间距离接近，表明这4组之间的微生物群落构成相似。

图3 假手术组和血管性认知障碍各组大鼠肠道菌群样品PCoA分析

3 讨 论

随着脑卒中发病率的升高，血管性认知障碍的患病率也明显增高[15]。而血管性认知障碍患者与常人相比更容易进展为痴呆，从而严重损害患者的身心健康和生活质量，加重其家庭与社会负担[16]。近年来，根据“脑肠轴”理论，调节肠道微生态从而改善认知的方法受到关注。大量研究认为中药可直接调节肠道菌群结构，改善微生态环境，使正常菌群健康的存活、生长，进而改善认知障碍[7]；且肠道菌群可通过影响口服中药在体内的吸收、代谢、转化，进而促进中药发挥疗效[17-18]。通过中药治疗调整肠道菌群失衡状态，促进益生菌生长，并抑制致病菌，纠正失衡的肠道菌群，符合“扶正驱邪”的中医治疗原则[18-19]。另外粪菌移植是调节肠道微生态的重要手段，这与中医药多靶点的治疗思路不谋而合。因此应用中医药和粪菌移植联合治疗血管性认知障碍有广阔的应用前景。

中医学认为血管性认知障碍属“痴呆”范畴，病位在脑，与心、肝、脾、肾均有关，为本虚标实之证，以肾虚为本，痰瘀火毒内阻，上扰清窍，使神明不清为标。通脑益智颗粒是由江苏省中医院全国名老中医符为民教授依据血管性认知障碍患者脾肾亏虚、毒瘀阻窍理论，以“益肾健脾、祛瘀泄毒”立法，总结60年临床经验而成，临床研究证实其可改善轻中度血管性认知障碍患者的认知功能、日常生活能力，延缓病程的进展[3]。

目前粪菌移植途径主要分为上消化道、中消化道、下消化道3种，当前多通过下消化道途径经结肠镜移植，使粪菌群直达病所，治愈率更高[20]。但结肠镜治疗是有创性操作，不但插管过程痛苦，操作过程中还存在损伤消化道黏膜、出血甚至穿孔等风险，且不能满足肠菌移植所需的多次操作，临床应用受到限制。口服粪菌制剂使用简便，患者依从性好，且研究证实口服粪菌胶囊治疗艰难梭菌感染疗效不亚于结肠镜给药[21]。

基于上述研究，本实验探讨了通脑益智颗粒联合粪菌移植(粪菌胶囊)对血管性认知障碍的影响及可能作用机制。结果Morris水迷宫实验显示，血管性认知障碍大鼠学习记忆能力明显下降；与模型组比较，多奈哌齐组、通脑益智组、粪菌移植组和通脑益智联合粪菌移植组大鼠学习记忆能力明显改善，其中通脑益智联合粪菌移植组大鼠逃避潜伏期缩短更明显，且该组大鼠在穿越平台等空间探索上表现更佳，这表明通脑益智颗粒联合粪菌移植在改善大鼠的空间学习和认知能力上有潜在优势。

肠道菌群中，厚壁菌门参与了肥胖、糖尿病、脂质代谢等疾病的进展，而肥胖和高血脂症是脑卒中及认知障碍发病的关键危险因素[22-23]。拟杆菌门可促进短链脂肪酸如乙酸、丙酸和丁酸的生成，短链脂肪酸缺乏会导致肠道功能紊乱，加重炎症反应，影响血脑屏障，最终会造成认知障碍的加重[24-25]。放线菌门属于益生菌；蓝藻菌门具有神经毒性，可通过引发氧化应激反应，降解谷胱甘肽，造成神经元凋亡[14，26]，诱导各种神经退行性病变[27]。本实验肠道菌群结构α多样性分析结果显示，模型组大鼠的OTU指数、Chaol指数、Simpson指数均明显低于假手术组，提示血管性认知障碍大鼠肠道菌群的多样性明显降低；通脑益智联合粪菌移植组大鼠的OTU指数、Simpson指数、Chaol指数均明显高于模型组，提示通脑益智颗粒联合粪菌移植可促进大鼠肠道菌群多样性恢复。肠道菌群门水平相对丰度分析显示，模型组大鼠肠道菌群中厚壁菌门相对丰度和蓝藻菌门相对丰度明显升高，拟杆菌门相对丰度、拟杆菌门/厚壁菌门比值和放线菌门相对丰度均明显下降，提示血管性认知障碍组大鼠存在肠道菌群比例失调；与模型组比较，通脑益智联合粪菌移植组大鼠肠道菌群中厚壁菌门相对丰度和蓝藻菌门相对丰度均明显下降，拟杆菌门相对丰度、拟杆菌门/厚壁菌门比值和放线菌门相对丰度均明显升高，提示通脑益智颗粒联合菌群移植能够调节大鼠肠道菌群紊乱，比单用多奈哌齐或通脑益智颗粒或菌群移植治疗更有利于维持肠道微生态的平衡。在属水平上，假手术组、通脑益智联合粪菌移植组、粪菌移植组和通脑益智组所在分支距离最近，表明这4组之间的微生物群落构成相似。因此推测通脑益智颗粒联合粪菌移植可能通过影响肠道微生物的稳态，促进菌群恢复平衡，使其逐渐趋向于健康大鼠肠道菌群，进而改善大鼠的认知功能。

综上所述，通脑益智颗粒联合粪菌移植能够更好地调整大鼠肠道菌群群落丰度、多样性及结构，维持肠道内环境稳态，从而改善血管性认知障碍大鼠的空间学习记忆能力，发挥治疗血管性认知障碍作用。但目前靶向肠道微生物以及粪菌移植针对神经系统疾病的治疗机制仍不明确，且相关临床研究还很缺乏，有待深入探讨。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。