梨幼果FWL1膜系统酵母双杂交三框cDNA文库构建及互作蛋白的筛选

赛静忆，温玥，郝志超，田嘉

（新疆农业大学园艺学院，乌鲁木齐 830052）

0 引言

【研究意义】果实大小为数量性状遗传，是由细胞大小和细胞数目共同决定的[1-3]。库尔勒香梨（PyrussinkiangensisYu）为蔷薇科（Rosaceae）梨亚科（Pomoideae）梨属（Pyrus.L）植物，是新疆特色水果之一[4]。库尔勒香梨皮薄肉脆、独特芳香、耐贮藏等，但果实偏小，平均单果重仅为100 g 左右，且可食部位较少。不同大小香梨果实经济价值差异较大。Fw2.2（fruit weight2.2）基因是影响果实大小中最重要的数量性状基因之一，在细胞分裂时期对细胞数目进行负调控，占整个果实大小变异的30%。但该基因为膜蛋白，不能直接行使其功能。分析研究梨FWL（fruit weight2.2-like）同源基因与其互作蛋白之间的关系，构建梨幼果FWL1 膜系统酵母双杂交三框cDNA 文库，对研究FWL1基因调节果实大小机理有重要意义。【前人研究进展】目前已经发现了多个与果实大小性状关联的基因，以不同方式影响植物生长发育，调控果实大小。目前，从番茄中分离的fw2.2 是目前已知调节果实大小最关键的基因。细胞分裂时期，在小果野生种表达量较高，在大果栽培品种中表达量较低，影响细胞数目，负调控果实大小，占整个果实大小变异的30%。fw2.2为细胞膜蛋白，不能直接行使其功能，通过酵母双杂交表明，与酪蛋白激酶II（CKII）调节亚基的同源蛋白相互作用[5]，调节细胞周期，进一步影响果实质量与体积[6]。李志超等[7]从酸浆属中分离了fw2.2 的同源基因，命名为Physalis Organ Size2（POS2），POS2不但影响果实大小，对其他组织和器官大小也具有负调控作用。POS2 同样为细胞膜蛋白，与PhysalisfloridanCKⅡβ1（PfCKⅡβ1）和MADS-box转录因子PfAGAMOUS-like（PfAG2）等蛋白发生互作，而PfAG2 能抑制PhysalisfloridancyclinD2；1（PfCyclinD2；1）的表达，对细胞分裂起到调控作用[7]。除了番茄与酸浆属，fw2.2 同源基因在水稻、玉米、鳄梨、大豆等物种中相继被分离出[8-11]，且皆具备调控细胞分裂、控制果实大小的作用。酵母双杂交技术是一种检测蛋白质互作的技术方法，目前已被应用在多个物种上。雷海英等[12]研究玉米中心蛋白（Zea maysL.centrin，ZmCEN）的生物学功能构建了玉米的酵母双杂交cDNA文库，筛出28个和ZmCEN有互作关系的蛋白质。王洋等[13]构建了番茄cDNA 酵母双杂交文库，筛选出了6个与Pti4 互作的转录因子。郑巧玲等[14]构建了山葡萄低温诱导酵母双杂三框cDNA 文库，筛选出VaPYL9 与VaCIPK18 有互作关系。【本研究切入点】前期从梨中分离出梨3个fw2.2 同源基因FWL[15-16]，但其调控梨果实大小机理尚不明确。需研究梨FWL1基因与其互作蛋白作用机理。【拟解决的关键问题】以杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香果实细胞分裂关键时期果肉组织为材料，构建梨幼果FWL1 膜系统酵母双杂交三框cDNA 文库，筛选出与梨FWL1 互作的蛋白，为梨FWL1基因调节果实大小机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 梨

杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香由新疆库尔勒市香梨研究中心科研实验基地采摘。每个品种分别选取一棵树势适中、生长状况良好、管理水平一致的10年生树，在果肉细胞分裂关键时期（授粉后15 d），每个品种分别采摘30个果实，去皮将果肉部分切下后立即置于液氮中，置于-80℃冰箱中保存备用。

1.1.2 主要试剂

Oligotex mRNA Kits（Qiagen，德国）、DEPC 水（Beyotime，中国）、无水乙醇（国药，中国）、Normal-RunTMprestained 250 bp-I DNA ladder（上海捷瑞，中国）、NormalRunTMprestained 250 bp-II DNA ladder（上海捷瑞，中国）、Supscript double stand cDNA Kit（invitrogen，美国）、Trimmer-2 cDNA normalization Kit（Evrogen，俄 罗 斯）、µltraPureTM Phenol：Chloroform Isoamyl：Alcohol（25：24：1，v/v）（sigma，美国）、pBT3-SUC（DUALsystemsBioTech，瑞士）、pBT3-STE（DUALsystemsBioTech，瑞士）、真核表达菌株NMY51（DUALsystemsBioTech，瑞士）、YPDA（陕西普因特，中国）、SD/-Leu with Agar（陕西普因特，中国）、SD/-Leu/-Trp with Agar（陕西普因特，中国）、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp with Agar（陕西普因特，中国）、酿酒酵母感受态制备及转化试剂盒（陕西普因特，中国）、3AT（Sigma，美国）、X-a-gal（Goldbio，美国）、Cycle-Pure Kit（OMEGA，中国）、TransStartFastPfu DNA Polymerase（全式金，中国）、Quick-Cloning MIX（陕西普因特，中国）、TransFastTaq DNA Polymerase（全式金，中国）。

1.1.3主要仪器

台式高速冷冻离心机（eppendorf，德国）、移液器（eppendorf，德国）、各型号离心管（Axygen，美国）、PCR仪（东胜，中国）、电转化仪（eppendorf，德国）、精密生化培养箱（上海精宏，中国）、恒温摇床（上海知楚，中国）、高速冷冻离心机（湖南湘仪，中国）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取

将杜梨、库尔勒香梨、鸭梨、早美香的幼果果肉组织放入带有液氮的研钵中，充分研磨至粉末状。选择Trizol 法对细胞的总RNA 进行提取，将洗脱下的RNA 取5µL 用于琼脂糖凝胶电泳的检测，其余放置在-80℃贮存。经NanoDrop 2 000核酸分析仪对总RNA的质量及其浓度鉴定。

1.2.2 mRNA分离

参照Oligotex mRNA Kits 说明书对mRNA 进行分离。

1.2.3 cDNA合成

在预冷的0.5 mL 无菌离心管中加入2µL mRNA 样品、1µL 的SMART ⅣOligonucleotide 及1µL 的CDS-3M PCR Primer，将其混匀后放入离心机内进行离心，将混合物于管底聚集，之后72℃，2 min，接着置冰上2 min，再次瞬时离心，让其均聚集于管底，向每一个管中加入2 µL 的5×First-Strand Buffer、1µL 的DDT（20 mM）、1µL 的dNTP Mix（10 mM）、1 µL 的PowerScriptTMReverse Transcriptase，轻轻吹吸使其充分混合，瞬时离心，42℃保育1 h，将离心管搁至在冰上，合成cDNA第一链。取一个新的离心管（0.5 mL）预冷，转入2µL 反转录产物，将其搁至冰上，准备进行后续步骤。

采用LD PCR对cDNA扩增，获得双链cDNA，将PCR 仪预热至95℃。在0.5 mL 反应管中加入以下试剂。表1

表1 二链合成cDNA所需试剂Table 1 Reagents required for two strand cDNA synthesis

轻弹离心管，瞬时离心，将管内物质集中在离心管的底部，滴入2 滴矿物油，覆盖管内物质，PCR 95℃预热后扩增，扩增步骤为95℃1 min，95℃10 s，68℃6 min（每过1个循环延伸时间增加5 s），20个循环，68℃5 min，16℃10 min。取5µL的产物进行电泳鉴定。

1.2.4 均一化处理

1.2.4.1 二链PCR产物纯化

使用QIAquick PCR Purification Kit 对二链PCR 产物纯化。按照5：1 的体积比例将PBI 溶液加入到PCR反应物内，将体系混合后加入吸附柱的膜上，10 000 r/min，1 min，弃滤液，加入0.75 mL PE Buffer 于膜上，10 000 r/min，离心1 min，取一个新的收集管，加入12µL纯化水于膜上。

1.2.4.2 杂交

在0.2 mL 无菌离心管中加入12µL SMARTprepared ds cDNA（1 200 ng of dissolved cDNA）、4µL 4×Hybridization buffer，混匀后瞬时离心，将其平均分为4 份，各滴入2 滴矿物油，13 000 r/min，室温离心2 min，于98 ℃下温浴2 min，之后在68 ℃下温浴5 h。

1.2.4.3 DSN处理

将1/2 倍（1 µL DSN storage buffer 与1 µL DSN混匀）置于冰上，68℃预热DSN master buffer，在每个PCR 管中加入5 µL 预热的DSN master buffer，混合至均匀，瞬时离心，之后迅速置于68℃，保温10 min。在管1（DSN1）中加入1 µL DSN 酶液，管2（DSN1/2）中加入1 µL 1/2DSN 酶液，管4（Control）中加入1 µL DSN storage buffer，管3（DSN1/4）不添加试剂，将其分别置于68℃保温25 min，加入10µL stop solution于每个管中，充分混合后瞬间离心，68℃下保温5 min，将PCR 管置于冰上并添入20µL纯化水行充分混合。

1.2.4.4 第1次PCR扩增经DSN处理的样品

对每个样品，在无菌的PCR 管内加入第1 次扩增的试剂。

将管内混合物混匀后瞬间离心。开始第1次PCR扩增，步骤为95℃1 min，95℃15 s，68℃6 min（每过1个循环延伸时间增加5 s），7个循环，68℃5 min。经对照以判断PCR的最适循环数，将剩余的样品搁于冰上保存。表2

表2 PCR扩增所需试剂Table 2 Reagents required for PCR amplification

1.2.4.5 第2次PCR扩增经DSN处理的样品

加入20µL纯化水于1倍酶处理的2µL PCR样品中，混合均匀后加入第2 次扩增的试剂，混匀，PCR 程序：95℃1 min，12个循环，95℃15s，66℃20s，72℃3min，接着64℃15s，72℃3min，取5µL电泳测定。

1.2.5 PCR产物纯化及二链回收

用QIAquick PCR Purification Kit 进行纯化，加41µL无菌水至膜上溶解，离心，测定浓度。二链回收用1×TAE 配置1%琼脂糖胶，点上Marker，隔一个以上泳道点样品，70 V 电压2 h，将Marker切下用含EB的电泳液染色15 ～20 min，用牙签标上1K、3K 的位置，对照样品切下1 ～3K 的区域，称取胶的重量。用QIAquick Gel Purification Kit纯化，按照胶100 mg约等于100µL计算。加进3倍体积的QG buffer，至50℃水浴10 min，直到胶全部融解，每2 min 进行颠倒混合均匀1 次，将化开胶液加至柱子，10 000 r/min 离心1 min，弃过滤物，在柱子膜上加750µL PE buffer，10 000 r/min，离心1 min，弃过滤物，12 000 r/min 甩干1 min，在膜上加15µL无菌水，12 000 r/min，1 min，保留滤下液体，确认其浓度。

1.2.6 cDNA与载体的连接

利用同源重组的方法，将3µL酶切后的线性化三框载体pPR3-N（双杂交）与上步中7 µL 的cDNA混合，取5µLInfusion重组酶、5µL水，将其充分融合后放入50 ℃中1 h，取2µL 蛋白酶K 对重组酶灭活，再加入78µL无菌水，将总体积加至100µL，之后依次加入1µL Glycogen（20µg/µL）、50µL 7.5 M NH4OAC、375µL 100%ethanol，充分混合，将其放在-80℃中至少1 h，在4℃下16 000 r/min 离心30 min，弃上清，加入150 µL70%的乙醇，在4℃下，16 000 r/min，离心3 min。再次重复这个过程，弃上清，保持cDNA沉淀，置室温下5 ～10 min 晾干cDNA，取10 µLDEPC 水重悬cDNA，用枪对其进行30 ～40 次吹吸，瞬时离心2 s 后对cDNA进行收取，即刻放置于冰上。

1.2.7 电转化大肠杆菌感受态细胞

在-80℃下放入1 mm 电击杯（Bio-Rad）进行30 min 的预冷处理，将感受态细胞50µL 及重组产物2.5 µL 在电击杯放在冰上的前提下一同放入杯内，持续放置45 min，经电转化仪（Bio-Rad）电击后，立即加入1 mL LB 培养基，将4次转化后的菌液转移至一个新的15 mL 离心管内，并加入培养基至5 mL，于37℃，225 ～250 r/min 培养1 h以上，之后把培养物稀释10、100、1 000、10 000倍，将不同倍数的稀释液分别涂10µL于平板上，其余置4℃过夜，也可倒上甘油使浓度至20%，于-80℃保存。

1.2.8 酵母双杂交文库质量及滴度检测

稀释经过转化的10µL原液至1 000倍，将其中100µL 涂在LB 平板上（具有氨苄抗性），次日统计算出文库的库容量（CFU/mL=平板上的克隆数/100µL×1 000 倍×1×103µL、文库总CFU=CFU/mL×文库菌液总体积mL）。扩增挑取的单克隆，用电泳对PCR 产物大小检测以鉴定插入片段的大小。稀释原核文库菌液10µL至106倍，将其中的100µL 涂在LB 平板上（含A+抗性平板），37℃过夜培养，次日统计，文库滴度CFU/mL=平板上的克隆数/100µL/10µL×106倍×1 000µL。

1.2.9 诱饵载体构建

利用前期克隆的梨果实大小相关基因FWL1（Genebank 收录号为：KM249876）[15]，根据pBT3-N、pBT3-C、pBT3-SUC、pBT3-STE 四个载体分别设计梨FWL1 基因全长设计引物，并以cDNA 为模板进行扩增，扩增过程为：95℃5 min，95℃30 s、56℃30 s、72℃2 min（该过程30个循环），72 ℃10 min。之后对PCR产物纯化回收。对pBT3-N/C/SUC/STE 载体进行酶切，按照线性化载体（pBT3-N/C/SUC/STE）50 ng、对应FWL1 cDNA50 ng、Quick-Cloning MIX2 5µL，补水至10µL 配置反应体系，用DNA 连接酶将PCR 产物与线性化pBT3-N/C/SUC/STE载体连接，55℃，20 min，30℃，30 min，取1.5 mL EP 管置于冰上，转化至Top10感受态细胞中，再加入2µL 连接产物，用手指轻轻弹EP 管2 次，置于冰上30 min，42℃热击90 s，迅速置于冰上5 min，加1 mL LB 液体培养基，37℃，150 r/min，震荡45 min，6 000 r/min 离心5 min，去上清，留100µL上清液吹打沉淀使之混匀，涂布对应抗性平板，37℃倒置过夜培养后挑取白色单克隆菌落摇菌，菌液PCR，各挑取阳性克隆斑至加有相应抗性5 mL LB 液体培养基的试管中，37℃，220 r/min培养12 h，小提质粒，用对应引物测序。表3

表3 PCR引物Table 3 List of PCR primers

1.2.10 诱饵表达载体自激活及功能测定

参考酿酒酵母感受态制备及转化试剂盒（货号PT1183）对NMY51 酵母进行感受态制备。将Carrier DNA 和pTSU2-APP 及pNubG-Fe65 混合，加入NMY51感受态和PEG/LiAc转化液，制备好后重悬，各取100 µL 分别涂布DDO/X（SD/-Leu/-Trp/X-a-gal）、QDO/X 平板（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-a-gal）平板，倒置于30℃培养箱内培养5d。对宿主（pTSU2-APP和pNubG-Fe65）检测。

将构建好pBT3-N/C/SUC/STE-FWL1 四个载体分别与pOst1-NubI、pPR3-N 混合，分别加入Carrier DNA（10µg/mL），分成8组，加入NMY51感受态50µL和PEG/LiAc 转化液500µL，制备好后重悬，1 ～4 组各取100 µL 分别涂布DDO（SD/-Leu/-Trp）及QDO/X（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/Xa-Gal）平板，5 ～6 组取100 µL 涂布SD/-Leu 平板，并倒置于30℃培养箱内培养5 d，对其进行功能检测和自激活检测。

取1支EP管，加入500µL 0.9%NaCl溶液，从上述转化NMY51[pBT3-N-FWL1&pPR3-N]平板挑取1 株状态较好菌落挑入EP 管中，混匀，均稀释OD值为0.1和0.01，并分别取2µL菌液分别点加在DDO、QDO/10mM3-AT、QDO/20mM3-AT、QDO/30mM3-AT、QDO/40mM3-AT、QDO/50mM3-AT平板上，30℃培养箱内培养3 d，观察生长状态。

1.2.11 互作蛋白的筛选

挑取NMY51（pBT3-N-FWL1）单菌落（直径2 ～3 mm）于YPD Plus 液体培养基培养；用TE/Li-Ac 感受态制备液重悬。在CarrierDNA 加入文库质粒，加入NMY51 感受态及PEG/LiAc 转化液进行培养，最后用NaCl 重悬，各取10 µL 转化液稀释10 000 倍取100 µL 分别涂布DDO（SD/-Leu/-Trp）平板上，并倒置于30℃培养箱内培养5 d，统计转化效率。将剩余转化液全部涂布于80个QDO/50mM3-AT（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/50mM3-AT）平板上，倒置于30℃培养箱内培养5 d，统计阳性克隆子。将筛选所得阳性克隆子分别转接于100µL 0.9%NaCl溶液中，测OD600值，通过补加适量0.9%NaCl 溶液使OD600 值为1，各取1µL菌液接种于QDO/50mM3-AT平板上，30℃培养3 ～5 d，对阳性克隆统计。挑单斑接种装有2 000µLSD/-Leu/-Trp 液体培养基中培养，220 r/min，30℃过夜培养，提取酵母质粒，将PCR 产物送测。

2 结果与分析

2.1 果肉组织总RNA提取

研究表明，28 S 与18 S 条带明晰，RNA 没有污染，较为完整。总RNA 经NanoDrop 2 000 测定后得出RIN≥7，A260/A280为2.01～2.08，其浓度及质量均达到要求。图1

图1 梨肉组织总RNA电泳Fig.1 Total RNA from pear fruit tissues separated on agarose gel

2.2 ds cDNA合成与鉴定

研究表明，ds cDNA 片段集中分布于250 ～2 000 bp，呈弥散状，包含不同大小和丰度差异的mRNA取得有效反转录，符合建库基本要求。图2

图2 LD-PCR 电泳Fig.2 LD-PCR amplification products by agarose gel electrophoresis

2.3 均一化ds cDNA鉴定结果

研究表明，经均一化处理过的ds cDNA 无特异性条带的出现，其覆盖片段长度范围与未均一化处理的ds cDNA 一致，且出现亮度较为统一的弥散状条带，不同片段的转录产物拷贝数已被调节至相似数目。图3

图3 均一化ds cDNA电泳Fig.3 Normalized ds cDNA by agarose gel electrophoresis

2.4 文库的构建及鉴定

研究表明，库容为3×107CFU，大于1×107CFU，该文库的库容量较高。平均插入片段大于1 000 bp，阳性率≥98%，该文库的重组率和随机性符合要求。平板上菌落数量大于600个，该文库滴度为≥6×108CFU/mL，文库的各类指标符合基本要求。图4

图4 均长检测Fig.4 Average length detection

2.5 诱饵表达载体自激活及功能检测

2.5.1 宿主检测

研究表明，无论在DDO/X 或QDO/X 平板上，均能生长出蓝色菌落，宿主基因型状态未发生突变，各报告基因能正常激活。图5

图5 宿主验证Fig.5 Host validation

2.5.2 功能检测和自激活检测

研究表明，共转组pBT3-N-FWL1 及pOst1-NubI和pBT3-N-FWL1及pPR3-N在DDO平板上能正常生长，在QDO/X 平板上能正常生长且变蓝；共 转 组pBT3-C-FWL1 及pOst1-NubI 和pBT3-C-FWL1 及pPR3-N 在DDO 平板上能正常生长，在QDO/X 平板上未能生长；共转组pBT3-SUC-FWL1及pOst1-NubI和pBT3-SUC-FWL1及pPR3-N 在DDO 平板上能正常生长，在QDO/X 平上未能生长；共转组pBT3-STE-FWL1 及pOst1-NubI和pBT3-STE-FWL1及pPR3-N在DDO平板上能正常生长，在QDO/X平板上只有少量菌斑变蓝。pBT3-N一个载体可用。图6

图6 诱饵表达载体功能和自激活检测Fig.6 Decoy expression vector function and self-activation detection

2.5.3 3-AT工作浓度检测

研究表明，NMY51（pBT3-N-FWL1&pPR3-N）在QDO/50mM3-AT 平板上生长受到抑制。图7

图7 NMY51（pBT3-N-FWL1&pPR3-N）生长情况Fig.7 Growth of NMY51（pBT3-N-FWL1&pPR3-N）

2.6 文库筛选

研究表明，每次筛选菌斑数＞1 000，转化率≥1.0×106CFU，共转效率达到筛库要求。图8

图8 筛库转化效率Fig.8 Screen storage conversion efficiency

2.7 酵母阳性克隆DNA提取和测序比对

研究表明，与梨FWL1 筛选互作蛋白长出了300个以上菌斑，在阳性克隆子转接测序中，共计长出274个阳性克隆，共计272个阳性克隆测序成功，在NCBI 数据库中进行BLAST 比对。有13个未知蛋白，6个蛋白出现频率在10次以上，其中collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1、metallothionein-like protein type 2、metallothionein-like protein（Met1）的预测功能显示与细胞分裂有关。表4

表4 出现10次以上的梨FWL1互作蛋白及其功能预测Table 4 FWL1 interacting proteins of pear with more than 10 occurrences and their functional prediction

3 讨论

酵母双杂交技术多用来研究蛋白互作及蛋白质的结构与功能[17]，也是迄今为止研究蛋白质互作中最常用的生物技术之一[18]。传统酵母双杂交系统适用于定位在细胞核内的互作蛋白。试验研究的FWL1 基因定位于细胞膜，不能直接行使功能，而DUAL membrane 技术在原有酵母双杂交系统的基础上，利用分离的泛素系统（splitubiquitin）进行蛋白质相互作用的筛选，为膜蛋白互作研究提供了可能[19]。酵母双杂交三框cDNA文库通过在普通单独文库上逐个增添了一个碱基于上游引物上，使得其读码框后移一到两位，用可能的3种读码框来表达克隆的cDNA，能够更好的捕捉生物体内真实的读码方式，确保筛选出所有可以正确表达的插入片段，提升了文库表达效率[20]。由于DSN 要求cDNA 片段长度和未经均一化处理的覆盖范围必须一致，能在不损坏大片段cDNA 的前提下，有效去除高丰度的cDNA[21]，增加文库内cDNA均一化程度。实验利用同源重组的手段连接了合成的cDNA及通过酶切处理后的pPR3-N 载体。基因组DNA 多个序列与线性化DNA两端具备同源性，这将大大提升后续重组连接的精确性。这种方法结合了其它连接方法的优点，降低了操作难度，提升了连接的效率，提升文库的质量[22]。

判断cDNA文库质量的重要指标是文库的库容和重组cDNA 序列的完整性[23]。文库当中的独立重组子克隆数就是该文库的库容量，独立重组子克隆数的数量代表了该文库的覆盖度。cDNA文库最少应当含有1×106CFU 的库容量[24]，经检测，研究所构建的梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA 文库的库容量为3×107CFU，大于1×106CFU。构建的炭疽菌侵染后刺葡萄果皮酵母双杂交cDNA文库、陆地棉酵母双杂交cDNA文库以及小麦酵母双杂交cDNA 文库的库容量均大于1×106CFU[25-27]。研究所构建的梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA文库符合建库的基本要求。重组cDNA序列完整性由重组率与插入片段的长度共同组成[21]。构建的草莓果实酵母双杂交文库、剑麻酵母双杂交cDNA 表达文库以及Cf-19 介导的抗番茄叶霉病免疫应答酵母双杂交cDNA文库的平均插入片段长度均大于500 bp，且阳性重组率为92%以上[28-30]。研究构建的cDNA文库经检测，

平均插入片段大于1 000 bp，阳性重组率≥98%。文库指标合格，符合后续筛库的基本要求。

筛选的272个互作的候选蛋白中，collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1、metallothionein-like protein type 2、metallothionein-like protein（Met1）的预测功能可能与梨果实细胞分裂有关。collagen and calcium-binding EGF domain-containing protein 1 为胶原蛋白和含钙结合EGF域的蛋白，EGF为表皮生长因子（epidermal growth factor EGF）[31-32]，EGF 可以促进细胞的增殖分化[33-34]，庞实锋等[35]将大豆油体和EGF 融合基因成功转化进红花细胞的基因组中，并证实表达的EGF 对一些细胞具有促细胞增殖活 性。 metallothionein- like protein type 2 和metallothionein-like protein（Met1）为金属硫蛋白（metallothionein，MT），其功能为螯合重金属离子及重金属解毒，参与必须微量元素的储存、运输和代谢，参与激素和发育过程的调节等[36]。Yuan等[37-38]研究发现水稻OsMT2b 参与了植物体内细胞分裂素的调控，MT 可能在细胞的修复、生长和分化过程中起着金属调节剂的作用[39]。梨FWL1可能与上述两个蛋白互作后调节梨果实大小。

4 结论

利用DUAL membrane 系统构建梨幼果膜系统酵母双杂交三框cDNA 文库，文库的库容量为3×107CFU，平均插入片段大于1 000 bp，阳性率≥98%，均达到cDNA 文库的建库标准，符合后续筛库的基本要求。诱饵载体无自激活功能，利用共转化方法，筛选出272个与FWL1互作的蛋白质，其中collagen and calcium-binding EGF domaincontaining protein 1 和metallothionein-like protein可能与梨果实大小发育有关。