甜菜黄萎病菌生物学特性及16种杀菌剂的毒力比较

荣 华，张卢慧，刘 龙，郑童童，雷 斌，郭庆元

（1.新疆农业大学农学院/新疆农林外来入侵有害生物监测预警与综合防控生点实验室，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院核技术生物技术研究所，乌鲁木齐 830091）

0 引言

【研究意义】甜菜（Beta vulgarisL.）是新疆优势经济作物[1]。新疆是我国最大的甜菜生产区，甜菜制糖业占全疆轻工业产值的1/4以上[1]，也是我国北方最大甜菜糖制糖基地[2]。病害发生制约着甜菜生产[3]。2016年新疆部分甜菜种植区内发现一种新的甜菜病害甜菜黄萎病[4]，其病原为变黑轮枝菌（Gibellulopsis nigrescens），该病原菌可以在土壤中存活数年[5-6]，植株主要发病症状表现为叶片局部黄化，半叶黄化，或脉间黄化，直至萎蔫、枯死。研究该病害的生物学特性及抑菌药剂，对该病害的防治有重要意义。【前人研究进展】Pethybridge[7]从马铃薯植株和块茎中分离得到产生厚垣孢子的一种真菌，通过形态学分类方法将其归属于Plectosp Haerellaceae 科Verticillium属，其命名为Verticillium nigrescens Pethybr；在近年有关分类研究中，又将该种划归Gibellulopsis属，其种名变更为Gibellulopsis nigrescens。对甜菜黄萎病的发生也有不少报道，但迄今国内对甜菜黄萎病的认识一直是将其作为植原体病害来理解[8-9]，赵志强等[4]也在近年报道了新疆采集的甜菜黄萎病是由变黑轮枝菌引起的。有研究者将病原鉴定为变黑轮枝菌（Gibellulopsis nigrescens）[10]和大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）[11-12]。【本研究切入点】由变黑轮枝菌（Gibellulopsis nigrescens）引起的甜菜黄萎病是一种国内新近发现的病害。目前，国内有关这一新发现的由变黑轮枝菌引起的甜菜黄萎病的研究和报道甚少。需研究该病病原菌特性，促进防治技术研究。【拟解决的关键问题】采用生长速率法，研究该病原菌营养特性、温度适应性、酸碱适应性、光照适应性等主要生物学特性，并针对该菌筛选出抑菌力较强的杀菌剂，为该病害防治技术研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

甜菜黄萎病病原菌（Gibellulopsis nigrescens）3个菌株BV3、BV4和BV5于2017年从新疆伊宁县阿热吾斯塘乡的甜菜发病处分离获得，保存于新疆农业大学农学院植物病理系作物病害研究室。

1.1.2 供试培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、查式培养基（Czapek）[13]、改良查式2 号培养基（NO.2 Czapek）[14]、水琼脂培养基（WA）、马铃薯培养基（PA）[15]。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖15 g，琼脂粉18 g，水1 000 mL。

查式培养基（Czapek）：硝酸钠2 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，加水1 000 mL。

改良查式2号培养基（NO.2 Czapek）：乳糖2 g，蛋白胨10 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01 g，琼脂粉14 g，加水1 000 mL。

水琼脂培养基（WA）：琼脂粉17 g，水1 000 mL。

马铃薯培养基（PA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，酵母膏1 g，；磷酸二氢铵0.5 g，硫酸镁1 g，琼脂粉20 g，水1 000 mL。

1.1.3 供试药剂及浓度

查阅黄萎病杀菌剂[16-17]相关文献，选择16种供试药剂。表1

1.1.4 供试菌菌饼

将病原菌挑取在PDA 培养基上培养，28 ℃，14 d，使其在培养皿大面积长满菌落后，用直径6mm打孔器切取菌饼备用。

1.2 方法

1.2.1 病原菌在不同培养基上的生长量测定

分别于马铃薯葡萄糖培养基（PDA）、查式培养基（Czapek）、改良查式2 号培养基（NO.2 Czapek）、水琼脂培养基（WA）、马铃薯培养基（PA）平板中央接种菌饼，每个菌株处理设3次重复，置于28 ℃恒温培养箱中培养，14 d 后采用十字交叉法[18]测量菌落直径，统计各菌株平均值。

1.2.2 病原菌在不同碳源培养基上生长量测定

以查式培养基为基础培养基，分别等量替换其中的碳源成分。供试碳源为葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖和木糖醇，分别在培养基中央接种菌饼，28 ℃恒温培养箱培养。每个菌株处理3 次重复，培养14 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，统计各菌株平均值。

1.2.3 病原菌在不同氮源培养基上生长量测定

以查式培养基为基础培养基，分别等量替换其中的氮源成分。供试氮源为硫酸氨、亚硝酸钠、硝酸钾、氯化铵和磷酸二氢铵，分别在培养基中央接种菌饼，28 ℃恒温培养箱培养。每个菌株处理3 次重复，培养14 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，统计各菌株平均值。

1.2.4 病原菌温度适应性

在PDA培养基平板中央接种菌饼，分别置于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃恒温培养箱培养。每个菌株处理设3 次重复，培养14 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，统计各菌株平均值，分析其生长温度和最适生长温度。

将直径为6 mm的菌块置于加有2 mL无菌水的已灭菌的3 mL 容量的指形管中，分别置于45、50、55、60、65、70、75 ℃的恒温水浴锅中处理10 min，取出迅速冷却；将菌块置于PDA平板上。每个菌株处理设3次重复，置于28 ℃恒温培养箱中培养，14 d 后确定菌丝致死温度范围。在致死温度范围内，以1 ℃为温度梯度，重复试验，确定该病原菌致死温度[19]。

1.2.5 病原菌光照适应性调查

在PDA培养基平板中央接种菌饼，分别置于24 h 光照、12 h 光照和12 h 黑暗交替和24 h 黑暗下，28 ℃恒温培养箱培养。每个菌株处理设3 次重复，培养14 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，统计各菌株的平均值，分析不同光照对菌落生长的影响。

1.2.6 病原菌酸碱适应性调查

用1 mol/L HCl 溶液和1 mol/L NaOH 溶液调节PDA 培养基的pH 值[20]分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，取15 mL 不同pH 值的培养基制备平板，在其中央接种菌饼，28℃恒温培养箱培养。每个菌株处理3 次重复，培养14 d 后采用十字交叉法测量菌落直径统计各菌株的平均值，分析不同酸碱条件对菌落生长的影响。

1.2.7 16种农药对病原菌的毒力测定

每一浓度药液吸取1 mL加入到9 mL的PDA培养基中制成含药平板，以无菌水为对照。在含药平板中央接种菌饼，28 ℃恒温培养箱培养。每处理3个重复，培养14 d 后采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率

1.3 数据处理

用SPSS 26.0求得毒力回归方程[21]、有效中浓度（EC50）和相关系数（R），根据EC50大小评价各杀菌剂的抑菌效果。

抑菌率=[（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/对照组菌落直径]×100%[22]。

2 结果与分析

2.1 病原菌营养特性

2.1.1 不同培养基对菌丝生长的影响

研究表明，病原菌在不同培养基上的生长速率有显著差异；不同菌株在同一种培养基上的生长速率也多有差异；所有菌株均在查氏培养基上生长速度最快，其次在马铃薯培养基、改良查氏2号培养基和PDA培养基上生长较快，在水琼脂培养基（WA）上生长速率最小；所有菌株在营养充足时，菌落生长较快的查氏培养基、马铃薯培养基（PA1）、改良查氏2号培养基、PDA 培养基上气生菌丝生长浓密，相反在水琼脂培养基（WA）上则气生菌丝较稀薄。图1

图1 不同培养基下菌落生长直径变化Fig.1 Comparison of colony growth diameters under different Medium

2.1.2 碳源、氮源对菌丝生长的影响

研究表明，病原菌各菌株均可利用所有5种碳源营养，使菌落生长增大，但不同的碳源营养对菌丝生长的影响差异不大；3个供试菌株在含有乳糖的培养基上菌丝生长最快，在含葡萄糖的培养基上菌丝生长最慢。图2

图2 不同的碳源下菌落生长直径变化Fig.2 Comparison of colony growth diameters under different carbon sources

病原菌各菌株均可利用所有5种氮源营养，使菌落生长增大，不同的氮源营养对菌丝生长的影响差异较大；供试菌株在以硝酸钾为氮源的培养基上生长最快，在以磷酸二氢铵作为氮源的培养基上生长最慢。图3

图3 不同氮源下菌落生长直径变化Fig.3 Comparison of colony growth diameters under different nitrogen sources

2.2 病原菌温度适应性

2.2.1 病原菌的生长温度及最适生长温度

研究表明，病原菌均可在5 ～35 ℃生长，在25 ～30 ℃时生长最快，且菌株之间差异不大。病原菌生长温度在5 ～35 ℃，最适生长温度为30 ℃。图4

图4 不同温度下菌落生长直径变化Fig.4 Comparison of colony growth diameters under different temperatures

2.2.2 病原菌的致死温度

研究表明，甜菜黄萎病菌在45 ～75 ℃，5 ℃为梯度的测定中，各菌株经45 ～55 ℃、10 min 恒温水浴处理后，仍能在PDA 培养基上继续生长，在60 ℃以上，病原菌全部致死。56 ～59 ℃，1 ℃为梯度的测定中，各菌株经56 ℃、10 min 恒温水浴处理后，病原菌仍能生长，在57 ℃以上，病原菌全部致死。该菌致死温度为57 ℃。

2.3 光照对菌丝生长的影响

研究表明，病原菌在全光照、光暗交替及全黑暗条件下，病原菌菌落生长速率整体上差异不大；3个菌株均在24 h 全光照下生长速度相对较快，在12 h 光照/12 h 黑暗下生长速度相对较慢。图5

图5 不同光照下菌落生长直径变化Fig.5 Comparison of colony growth diameters under different lights

2.4 pH值对菌丝生长的影响

研究表明，3个供试菌株在pH值4.0 ～11.0时均可生长，随着pH 值的增高，碱性增强，菌丝生长速度加快。其酸碱适应范围广，最适生长环境为碱性环境，对偏酸性环境也有较好的耐受性。图6

图6 不同pH培养基上菌落生长直径变化Fig.6 Comparison of colony growth diameters on different pH

2.5 甜菜黄萎病病原菌抑菌药剂室内筛选

研究表明，16种化学农药对病原菌生长均有抑制，各药剂之间抑制作用有明显差异；有9种化学农药对病原菌生长具有较好的抑制作用，其中40%多菌灵和450 g/L 咪鲜胺对病原菌的抑制作用极强，EC50值分别为0.089 1 和0.91 mg/L；30%噁霉灵、30%苯甲丙环唑、1.8%辛菌胺醋酸盐次之（EC50：100 ～155 mg/L）；80%代森锰锌、430 g/L 戊唑醇、80%乙蒜素、125 g/L 氟环唑再次之（EC50：309 ～838 mg/L）。表2

表2 16种杀菌剂对甜菜黄萎病菌的毒力（抑菌中浓度）Table 2 Virulence of 16 fungicides to Gibellulopsis nigrescens（concentration in antibacterial）

3 讨论

变黑轮枝菌能够在10 ～35 ℃时生长，35 ℃时生长微弱[23]；在pH4时可以生长，在水琼脂培养基中生长缓慢，研究的关于甜菜黄萎病菌的生物学特性与该研究基本一致。目前关于黄萎病的生物学特性和药剂试验相关报道有许多，但关于甜菜黄萎病菌的生物学特性和室内药剂筛选研究在国内还未见具体报道，由于试验药剂筛选结果仅仅是在病原菌菌丝与药剂直接接触产生的抑制效果，不同药剂作用在植物上的机理不同，而且药剂在田间防效还受到寄主植物、病原菌浓度、药剂的附着渗透能力以及环境条件的综合影响[24-25]，并不能完全代表该病菌的田间实际防效。还需要进一步研究确定其抑菌最适浓度和防治效果，进行田间药效试验。

4 结论

4.1 甜菜黄萎病病原菌G.nigrescens菌丝生长最适培养基为查氏培养基，能利用多种碳源和氮源，乳糖是最佳碳源，硝酸钾是最佳氮源；病原菌生长温度在5 ～35 ℃，最适生长温度为25 ～30 ℃，致死温度为57 ℃；酸碱度适应范围广，在pH值4.0 ～11.0均可生长，对碱性环境适应较好，有较强的耐酸性。

4.2 16种供试药剂均对病原菌有显著不同抑制效果，40%多菌灵和450 g/L咪鲜胺对病原菌的抑制作用极强，EC50值分别为0.089 1 和0.91 mg/L；30%噁霉灵、30%苯甲丙环唑、1.8%辛菌胺醋酸盐次之（EC50：100 ～155 mg/L）次之。