不同地理种群棉蚜三种关键性酶活差异及其与抗性相关性

王小丽，韩 睿，张全成，赵鹏程，王俊刚

（1.石河子大学农学院/新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室，新疆石河子 832003；2.新疆天禾嘉信农业科技有限公司，乌鲁木齐 830000）

0 引言

【研究意义】新疆是我国棉花重要产区，而棉蚜Aphis gossypii（Glover）是棉花的重要害虫之一。棉蚜为蚜科蚜属，蚜虫防治药剂的重复和不规范使用，会使蚜虫产生抗药性[1-3]。而羧酸酯酶（CarE）、乙酰胆碱酯酶（AchE）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等酶活性增加是昆虫抗药性产生的一类重要机制，与棉蚜抗药性之间存在一定关系[4-10]，测量不同地理种群棉蚜的3种酶活及分析酶活力对吡虫啉抗性产生的作用，对棉蚜的防治和相关研究有重要意义。【前人研究进展】羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶与昆虫的抗药性存在一定关系，在大垫尖翅蝗对丁烯氟虫腈的抗性研究中，发现羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶是抗性产生的因素之一[4]，李永强等[5]研究表明，棉铃虫体内的8个羧酸酯酶对2种拟除虫菊酯类和2种有机磷类杀虫剂有一定的解毒代谢活性，谷胱甘肽-S-转移酶还参与了烟粉虱对吡虫啉的抗性形成[6]，而乙酰胆碱酯酶的敏感性下降与二化螟对三唑磷抗性产生有关[7]，胡珍娣[8]在继代汰选过程中发现羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶对氯虫苯甲酰胺有一定的解毒活性。3种酶与蚜虫的抗药性存在关系，在室内的麦二叉蚜抗性选育过程中，乙酰胆碱酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶与麦二叉蚜对吡虫啉的敏感性存在一定关系[9]，郭天凤等[10]研究表明，抗吡虫啉和抗啶虫脒棉蚜两种抗性品系中，羧酸酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶的活性均高于敏感品系，而羧酸酯酶在棉蚜对吡虫啉和啶虫脒抗性中起到了重要作用。【本研究切入点】新疆棉花种植面积大，区域广[11]，不同地区用药量和打药方式存在差异，导致不同地理种群棉蚜抗药性不同[12]。需研究不同地理种群棉蚜和敏感种群棉蚜体内3种酶活性，了解棉蚜的抗药机制，探索不同地理种群棉蚜3种酶活性与吡虫啉抗性的关系。【拟解决的关键问题】研究新疆5个地区不同地理种群棉蚜体内3种酶活性的，了解新疆不同地区棉蚜与敏感种群棉蚜的2种关键解毒酶和1种神经传导关键性酶比活力，以及对吡虫啉的抗药性，为相关研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试棉蚜：2017年7～8月，采自库尔勒地区、五家渠101团老九连、奎屯130团团部周边、石河子147团和哈密农业技术推广站试验田。相对敏感种群棉蚜采集于石河子大学试验场，在实验室继代培饲养20代以上（SS）。

试剂及仪器：1-氯-2，4-二硝基苯、还原型谷胱甘肽、固蓝B 盐、二硫代双硝基苯甲酸、十二烷基硫酸钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、α-醋酸萘酯、考马斯亮蓝、毒扁豆碱、牛血清蛋白、磷酸缓冲液、吐温-80、丙酮，均产自上海源叶生物科技有限公司。UV-1800日本岛津紫外可见分光光度计，日本岛津公司；电热恒温水浴锅，北京长安科学仪器厂；玻璃匀浆器，上海垒固仪器有限公司；高速冷冻离心机，LQP-B-4型制冰机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 毒力测定

生物测定采用叶片浸渍法，加以改动。将杀虫剂用少量的丙酮使其溶解，用0.05%吐温-80溶液将溶解的杀虫剂稀释成5个浓度。选择新鲜棉叶，在配好的溶液中浸泡10 s，取出后自然晾干，放入含有琼脂的培养皿内。每个处理选择个体大小均匀一致的20 头无翅蚜进行试验，以0.05%的吐温-80溶液为对照，重复3次。试验条件为温度（26±1）℃、光周期16 L：8 D、相对湿度55%～70%。24 h 后检查棉蚜死亡情况，以毛笔轻轻触动足和触角无反应为死亡判定标准。

1.2.2 生化测定

1.2.2.1 羧酸酯酶活力

（1）酶源制备

玻璃匀浆器中加入5 mL（0.04 mol/L pH7.0）的磷酸缓冲液，将150 头无翅成蚜在冰浴条件下完全匀浆，置于4℃，8 000 r/min下离心20 min，取稀释50倍后的上清液作为酶源，重复3次。

（2）活力测定

参照Van Aspern[13]的方法，加以改动。试管中加入5 mL（3×10-4mol/L）α-醋酸萘酯，1 mL 酶源，30℃水浴下30 min 后加入1 mL 显色剂，底物常温下静置20 min，在600 nm下测量OD值，每组重复3 次。将酶含量（mL）作为自变量，OD 值为因变量，利用标准曲线算出1 mL 酶液所生成的α-萘酚的量，最后结合蛋白质含量（mg/g）计算出羧酸酯酶的比活力。

1.2.2.2 乙酰胆碱酯酶活力

（1）酶源制备

玻璃匀浆器中加入3 mL（0.1 mol/L pH7.4）的磷酸缓冲液，将200 头无翅成蚜在冰浴条件下完全匀浆，置于4℃，8 000 r/min下离心20 min，取上清液作为酶源，重复3次。

（2）活力测定

参照高希武等[14]的方法，加以改动。在试管中加入2.2 mL（0.1 mol/L pH7.4）的磷酸缓冲液、0.4mL酶源、0.1mLAsch-DTNB（1：2）混合液，将试管中试剂混匀，在27℃水浴振荡条件下反应15 min，再加入0.5 mL（1×10-3mol/L）毒扁碱，将试剂在412 nm 下测定OD 值，每组重复3 次。以酶含量（mL）为自变量，OD值为因变量，根据标准曲线计算乙酰胆碱酯酶的比活力。

1.2.2.3 谷胱甘肽-s-转移酶活力

（1）酶源配制

玻璃匀浆器中加入2 mL（66 mol/L pH7.0）的磷酸缓冲液，将150 头无翅成蚜在冰浴条件下完全匀浆，置于4℃，9 000 r/min下离心15 min，取上清液作为酶源，重复3次。

（2）活力

参照Habig等[15]方法，加以改动。试管中加入2.4 mL（66 mol/L pH7.0）的磷酸缓冲液、0.3 mL（50 mol/L）谷胱甘肽、0.1 mL（0.03 mol/L）CDNB，将试管中试剂混匀，在27℃水浴振荡条件下反应15 min，再加入0.2 mL 酶液，在室温下340 nm 处比色，测定5 min内OD变化值，每组重复3次。

1.2.3 酶原蛋白含量

（1）酶源制备

玻璃匀浆器中加入5 mL（0.04 mol/LpH7.0）的磷酸缓冲液，将120 头无翅成蚜在冰浴条件下完全匀浆，置于4℃，8 000 r/min下离心15 min，取上清液稀释50倍后作为酶源，重复3次。

（2）酶源蛋白质含量测定

参考Bradford[16]的方法，试管中加入0.1mL酶液，对照试管中加入0.1 mL（0.04 mol/L pH7.0）的磷酸缓冲液，再分别加入5 mL 考马斯G-250 试剂，在25℃水浴下放置2 min，在595 nm 处测OD值。每组重复3次，取平均值，根据标准曲线计算蛋白质含量。

1.3 数据处理

采用SPSS20.0进行数据处理和方差分析，并用Excel绘制图表。

2 结果与分析

2.1 不同地理种群棉蚜羧酸酯酶比活力

研究表明，棉蚜SS种群羧酸酯酶比活力为0.236（U/mgpro-min），除哈密地区棉蚜种群羧酸酯酶比活力为0.284（U/mgpro-min）外，其余地区棉蚜种群羧酸酯酶比活力均远高于SS种群，差异显著（P＜0.05）。库尔勒、五家渠、石河子、奎屯和哈密地区棉蚜种群对SS种群羧酸酯酶比活力比值为6.5、4.2、3.4、2.7和1.2倍，不同地理种群之间棉蚜羧酸酯酶比活力差异显著（P＜0.05）。表1

表1 不同地理种群棉蚜的羧酸酯酶比活力Table 1 CarE activities in wingless adults of different geographic populations of Aphis gossypii

2.2 不同地理种群棉蚜乙酰胆碱酯酶的比活力

研究表明，棉蚜SS种群乙酰胆碱酯酶比活力为2.997（U/mgpro-min），各地区棉蚜种群乙酰胆碱酯酶比活力均远高于SS种群，且差异显著（P＜0.05），其库尔勒地区棉蚜种群和SS 棉蚜种群乙酰胆碱酯酶比活力存在极显著差异（P＜0.01）。库尔勒、五家渠、石河子、奎屯和哈密地区棉蚜种群对SS种群乙酰胆碱酯酶比活力比值为4.2、2.7、2.3、2.5和2.1倍，且不同地理种群之间棉蚜乙酰胆碱酯酶比活力也存在显著差异（P＜0.05）。表2

表2 不同地理种群棉蚜的乙酰胆碱酯酶比活力Table 2 AchE activities in wingless adults of different geographic populations of Aphis gossypii

2.3 不同地理种群棉蚜谷胱甘肽-S-转移酶比活力

研究表明，SS 棉蚜种群谷胱甘肽-S-转移酶比活力为3.986（U/mgpro-min），各地区棉蚜种群谷胱甘肽-S-转移酶比活力均远高于SS种群，且差异显著（P＜0.05）。不同地理种群之间棉蚜谷胱甘肽-S-转移酶比活力也存在显著差异（P＜0.05）。库尔勒、五家渠、石河子、奎屯和哈密地区棉蚜种群对SS棉蚜种群谷胱甘肽-S-转移酶比活力比值为2.3、1.5、1.3、2.5和2.1倍。

表3 不同地理种群棉蚜的谷胱甘肽-S-转移酶比活力Table 3 GST activities in wingless adults of different geographic populations of Aphis gossypii

2.4 不同地理种群棉蚜3种酶活性与吡虫啉抗药性的相关性

研究表明，通过对各个地区棉蚜种群吡虫啉抗性及3种酶活性之间的联系分析，棉蚜体内的2种关键解毒酶和1种神经传导关键性酶和吡虫啉抗性之间存在一定相关性。各棉蚜种群羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性随着吡虫啉抗性增减而增减，羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶极有可能参与了棉蚜对吡虫啉的抗性形成过程。图1

图1 不同地理种群棉蚜对吡虫啉抗性与3种酶活性的相关性Fig.1 Relationship between imidaclopridresistance to Aphis gossypii and three enzyme activities in different geographical populations

3 讨论

研究表明，棉蚜对杀虫剂产生中等高抗水平时，往往是靶标基因变异导致靶标敏感性下降；棉蚜对杀虫剂产生低水平抗性时一般是棉蚜体内解毒酶活性的上升导致的[17]。试验以赵鹏程[18]研究为基础，发现新疆不同地理种群棉蚜对吡虫啉的抗性还处于抵抗水平，试验选用了吡虫啉的抗性水平，分析吡虫啉的抗性形成机制是否与解毒酶活性有关，羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶活性变化与吡虫啉抗性变化呈正相关。

羧酸酯酶可以水解酯类化合物的酯键或与亲酯类化合物结合[19]。而研究中羧酸酯酶对吡虫啉杀虫剂也起到了非常好的作用。各地区羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶均低于敏感品系，但羧酸酯酶活性的变化比乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽-S-转移酶显著，羧酸酯酶在棉蚜对新烟碱类杀虫剂敏感性下降有关。羧酸酯酶同样能介导昆虫对新烟碱类杀虫剂的抗性[20-23]。杨柳等[20]测定了湖南宁乡地理种群烟蚜和敏感种群烟蚜的解毒酶活性，结果表明宁乡烟蚜种群乙酰胆碱酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶分别是敏感种群1.68 倍、2.58 倍、2.39 倍，均显著高于敏感种群，且羧酸酯酶在烟蚜对灭多威及辛硫磷敏感性降低起到重要作用。史晓斌等[21]测定吡虫啉抗性品系和敏感品系羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和乙酰胆碱酯酶，发现羧酸酯酶活性变化较快，谷胱甘肽-S-转移酶增加较慢，羧酸酯酶在棉蚜对吡虫啉产生抗性中起到重要作用。王晓冰[22]对绿盲蝽进行了抗呋虫胺品系的汰选，在汰选过程中发现羧酸酯酶活性有明显的提升，认为羧酸酯酶参与了绿盲蝽代谢呋虫胺过程。杨焕清等[23]研究发现棉蚜对吡虫啉抗性的形成与羧酸酯酶活力增加有关。

不同地区棉蚜种群之间抗性水平不一致，其解毒酶活性也存在差异[24-30]。研究表明，库尔勒棉蚜种群羧酸酯酶比活力和乙酰胆碱酯酶比活力是敏感棉蚜的6.5 倍和4.2 倍，均高于其他地区棉蚜种群；其中哈密地区棉蚜种群解毒代谢酶活力低于其他地区，可能与采集测定的时间，棉蚜发生早晚，蚜虫还没有大面积接触杀虫剂等有关。

4 结论

各地理种群棉蚜3种酶活性均显著高于敏感种群（P＜0.05），且彼此之间存在差异性，羧酸酯酶在棉蚜感受到吡虫啉杀虫剂胁迫时极有可能起到重要作用。棉蚜体内羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶和乙酰胆碱酯酶抗性之间存在一定相关性，棉蚜抗性强的地区其解毒代谢作用强烈，3种酶也随之表现出较高的活性，其中各地区棉蚜种群羧酸酯酶活性变化最大。