鲍曼不动杆菌耐药性与外排泵基因、外膜孔蛋白基因的相关性研究*

陈荣忠，杨子依，向 蓉△

1.南方医科大学附属小榄医院检验科，广东中山 528415；2.邵阳学院医学检验学院，湖南邵阳 422000

鲍曼不动杆菌为革兰阴性球杆菌，常存在于人体的皮肤、口腔、呼吸道、胃肠道和泌尿道中，在自然环境中分布广泛，可存在于医院各种环境中，近些年来已成为医院内感染的重要病原菌之一。鲍曼不动杆菌具有多种耐药机制，随着抗菌药物的广泛使用，导致鲍曼不动杆菌的检出率及耐药率居高不下，2020年CHINET细菌耐药监测数据显示，鲍曼不动杆菌对美罗培南的耐药率为73.4%[1]。碳青霉烯酶的产生是耐碳青霉烯类抗菌药物的鲍曼不动杆菌(CRABA)的主要耐药机制，而主动外排泵系统的表达以及外膜孔道蛋白的丢失或突变也是其重要的耐药机制之一。本文通过分析鲍曼不动杆菌主动外排泵相关基因以及外膜孔蛋白carO基因的表达，进一步探讨CRABA菌株对碳青霉烯类抗菌药物的分子流行病学情况。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集广东省中山市西北部区域2019年1月至2021年12月临床分离的鲍曼不动杆菌共152株(剔除重复株，同一患者只留取首次分离株)，其中CRABA 86株，对碳青霉烯类抗菌药物敏感的鲍曼不动杆菌(CSABA)有66株。

1.2仪器与试剂

1.2.1主要仪器 VITEK-2全自动微生物鉴定和药敏分析仪(法国生物梅里埃公司)，凝胶成像仪(美国Bio-rad公司)，2720Thermal Cycler PCR扩增仪(美国ABI公司)，DYY-2C型水平电泳仪(北京六一仪器厂)。

1.2.2主要试剂 哥伦比亚血平板、MH琼脂平板购自广州市迪景微生物科技有限公司，替加环素药敏缓冲液购自珠海迪尔生物有限公司，外排泵基因及外膜孔蛋白carO基因引物(表1)、DNA Marker、Premix溶液等PCR实验相关试剂购自上海生工生物工程股份有限公司，质控菌株为大肠埃希菌(ATCC25922)，铜绿假单胞菌(ATCC27853)均购自卫生部临床检验中心。

表1 靶基因PCR扩增引物及产物长度

1.3方法

1.3.1收集CRABA菌株来源患者的临床资料 收集CRABA菌株来源患者的一般资料，包括性别、年龄，菌株来源科室、标本等。

1.3.2药物敏感试验 严格按照2020年CLSI-M100第30版[2]推荐的方法进行药敏试验，采用VITEK-2全自动微生物鉴定和药敏分析仪检测细菌的最低抑菌浓度(MIC)，纸片扩散法(K-B法)检测细菌的抑菌圈直径。对于替加环素K-B法的药敏折点，参照美国FDA的药敏标准进行判读[3]。头孢哌酮/舒巴坦的药敏折点参照头孢哌酮的药敏标准进行判读[4]。

1.3.3基因检测 挑取新鲜菌落，采用加热煮沸法制备细菌DNA模板，PCR扩增6种外排泵基因(ade B、ade R、ade S、ade J、abe M)和外膜孔蛋白carO基因(外排泵基因反应参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s共30个循环；72 ℃ 7 min。carO基因反应参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 60 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s共30个循环；72 ℃ 7 min)，扩增产物经2%琼脂糖凝胶、120 V电泳约25 min，通过凝胶成像仪获取图像及进行分析。

1.3.4基因测序 PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行纯化及测序，结果在NCBI上经BALST比对。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0软件进行数据统计分析，应用WHONET 5.6软件对鲍曼不动杆菌的抗菌药物敏感性进行描述性分析，计数资料用百分率表示，比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CRABA菌株来源患者的临床资料 86株CRABA临床菌株来源患者的年龄为7 d至99岁，其中男性患者56例，女性患者30例，男女比例为1.87∶1。86株CRABA菌株主要分布于重症监护室48株(55.8%)，神经外科11株(12.8%)，神经内科8株(9.3%)，胸心外科6株(7.0%)，呼吸内科5株(5.8%)，内分泌科2株(2.3%)，骨科、妇科、口腔科、感染科、手外科以及肿瘤科各1株。86株CRABA菌株来源标本的类型以呼吸道标本为主，占86.0%；其次为伤口分泌物，占7.0%；血液标本占3.5%；尿液标本占2.3%；脓液标本占1.2%。

2.2药物敏感试验 对152株鲍曼不动杆菌进行14种抗菌药物的体外敏感试验(表2)，其中CRABA对抗菌药物的耐药性明显高于CSABA，差异具有统计学意义(P<0.05)。其中有4株CRABA菌株对替加环素耐药，耐药率为5.6%；CRABA对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率为24.4%，对米诺环素的耐药率为58.0%，对其余抗菌药物的耐药率均高于70%。

表2 152株鲍曼不动杆菌对14种抗菌药物的耐药率

2.3外排泵基因的检测 152株鲍曼不动杆菌中，分别检出ade B 122株、ade R 104株、ade S 114株、ade J 138株、abe M 146株，并对扩增产物进行测序确认，见图1。86株CRABA菌株中ade B(95.3%，82/86)、ade R(80.2%，69/86)、ade S(94.2%，81/86)以及ade J(96.5%，83/86)的检出率明显高于66株CSABA菌株中ade B(60.6%，40/66)、ade R(53.0%，35/66)、ade S(50.0%，33/66)以及ade J(83.3%，55/66)的检出率，差异均有统计学意义(P<0.05)；abe M基因在CRABA与CSABA菌株中的检出率差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

注：M为DNA Marker；1～2为ade B外排泵基因(541 bp)；3～4为ade R外排泵基因(447 bp)；5～6为ade S外排泵基因(544 bp)；7～8为ade J外排泵基因(463 bp)；9～10为abe M外排泵基因(703 bp)。

2.4外膜孔蛋白carO基因的检测 152株鲍曼不动杆菌中，共检出carO基因135株，检出率为88.8%，扩增产物进行测序确认，见图2。其中carO基因在CRABA菌株的检出率(95.3%)明显高于CSABA菌株(80.3%)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

注：M为DNA Marker；11～16为carO基因(750 bp)。

表3 CRABA和CSABA菌株外膜孔蛋白carO基因及外排泵基因检出率比较[n(%)]

3 讨 论

鲍曼不动杆菌可引起呼吸机相关性肺炎和血流感染，具有很高的发病率及病死率，尤其是CRABA的出现和传播，给临床的抗感染治疗带来重大挑战。由于鲍曼不动杆菌是医院内感染的重要病原体，对其菌株进行流行病学以及相关耐药机制的研究十分必要。本研究对鲍曼不动杆菌的临床数据以及耐药性分析显示，鲍曼不动杆菌的分离株主要存在于重症监护室、神经外科以及神经内科，常见于长期卧床、有侵入性操作史和免疫功能低下的患者。CRABA菌株对抗菌药物的耐药性明显高于CSABA。其中CRABA菌株对替加环素的耐药率最低(5.6%)，头孢哌酮/舒巴坦(24.4%)以及米诺环素(58.0%)次之，对其他抗菌药物的耐药率均高于70%，该结果与2020年CHINET细菌耐药监测数据较一致[1]。抗菌药物的持续过度使用导致鲍曼不动杆菌的耐药性增强，其原因可能是通过基因水平转移获得了各种抗菌药物抗性基因[5]或其他因素[6]导致，包括膜通透性降低、抗菌药物靶位的改变、水解酶的产生、外排泵的过度表达以及生物膜的形成等。在所有耐药机制的研究中，外排泵因其广泛的底物特异性和在不同细菌中的广泛分布而成为重要的耐药决定因素之一。

鲍曼不动杆菌的基因组富含药物主动外排泵基因，其外排泵对多种底物表现出特异性，例如抗菌药物、去污剂、杀菌剂以及染料等，除此以外还可排出具有不同生理功能的关键分子，其中最常见的是耐药结节分化家族，主要介导鲍曼不动杆菌的固有耐药以及获得性耐药。本研究表明Ade ABC、Ade IJK、Abe M外排泵及调控基因(ade R、ade S)广泛分布于临床鲍曼不动杆菌分离株中，CRABA菌株各基因的检出率在80%～98%，CSABA菌株各基因的检出率在50%～92%，与BADWY等[7]研究结果相似。在CRABA菌株中ade B基因的检出率高达95.3%，与CSABA菌株的检出率(60.6%)相比，差异有统计学意义(P<0.05)，表明ade B基因是Ade ABC外排泵产生耐药的主要因素[8-9]。Ade ABC外排泵的表达受上游双组分调控系统Ade RS控制，Ade RS通过碱基的突变可引起Ade ABC外排泵的过度表达，本研究发现CRABA菌株中ade R及ade S基因的检出率明显高于CSABA菌株，进一步推测在CRABA菌株中Ade RS控制系统更容易引起Ade ABC外排泵的高表达，从而导致菌株耐药性的增高。Ade IJK外排泵主要与Ade ABC外排泵组成复合体结构，对宿主细胞产生毒素作用，Ade J外排泵与Ade B外排泵具有协同效果，Ade J外排泵可利用四环素类抗菌药物的疏水特性进行识别，可能成为耐替加环素鲍曼不动杆菌的优势基因[10-11]。本研究中ade J基因检出率在CRABA与CSABA菌株间差异有统计学意义(P<0.05)，其中4株对替加环素耐药的CRABA菌株均检出ade J和ade B基因。MATE家族中的Abe M外排泵以H+驱动力作为主要能量，程建军等[10]研究表明abe M基因的高表达与鲍曼不动杆菌的多重耐药密切相关，BRATU 等[12]研究指出 abe M基因对鲍曼不动杆菌菌株多重耐药性的参与较弱。本实验发现abe M基因检出率在CRABA菌株与CSABA菌株间差异无统计学意义(P>0.05)，可能与对碳青霉烯类抗菌药物的耐药无关，而ade B、ade R、ade S以及ade J基因的检出率在CRABA与CSABA菌株间差异有统计学意义(P<0.05)，提示本地区CRABA的耐药性与AdeABC及Ade IJK外排泵密切相关。

在鲍曼不动杆菌的外膜蛋白中，carO是仅次于OmpA的第二丰富蛋白质，可通过抑制NF-κB信号传导影响鲍曼不动杆菌在宿主细胞中的黏附和毒力[13],同时carO蛋白参与了亚胺培南、鸟氨酸在鲍曼不动杆菌外膜中的选择性渗透[14]，因此当它发生丢失或突变时，与碳青霉烯类抗菌药物的获得性耐药存在一定联系[15]。本研究发现，carO基因的检出率在CRABA与CSABA菌株间差异有统计学意义(P<0.05)，carO基因在CRABA菌株中更容易检出。该结果与ABBASI等[16]研究相符，但与潘红超等[17]的研究不同，可能是由于多种carO 多态性变体共存于对亚胺培南具有不同特异性的鲍曼不动杆菌种群中所引起，因此还需要对carO蛋白的mRNA做定量分析，有助于了解carO蛋白在不同鲍曼不动杆菌中的表达。

综上所述，鲍曼不动杆菌的耐药机制十分复杂，不同耐药机制之间交错联系，外膜孔蛋白以及外排泵系统是本地区CRABA的主要耐药机制之一，其中abe M基因可能与CRABA菌株耐药性无关。本研究的不足之处在于没有对外排泵基因及外膜孔蛋白基因的表达做定量分析，将在以后的研究中补充，以期进一步明确鲍曼不动杆菌的相关耐药机制。