一种赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长和水质影响

管立平，谢晶晶，李伟豪，陈昊震，温振中，孙成波,2,3

(1 广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088；2 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江)，广东 湛江 524025；3 广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室，广东 湛江 524088)

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)原产于太平洋沿岸水域，因其具有适应性强生长速度快、产肉率高等优点，在世界范围内被广泛养殖[1]。随着凡纳滨对虾养殖业的迅猛发展，经历了数年大规模高密度养殖，养殖生产中用药量不断增加，导致水环境污染负荷日益加重、病害频繁发生、养殖产品质量下降，严重影响到了水产品安全和产业的可持续发展，促使人们越来越关注通过运用微生物制剂净化养殖尾水及循环利用的研究及方法[2-5]。

微生物制剂被广泛运用及微生物制剂的研究证实有利于增强养殖凡纳滨对虾的免疫能力和提升凡纳滨对虾养殖生产的综合效益，但在凡纳滨对虾养殖的过程中，需充分考虑具体的凡纳滨对虾养殖环境以及相关影响因子，科学运用微生态调控技术，制定有效的凡纳滨对虾养殖方案，保障养殖凡纳滨对虾的品质安全，尽可能降低凡纳滨对虾养殖对环境的污染，减少疾病的发生，达到凡纳滨对虾养殖的可持续的发展[6]。在常用的微生态制剂中，芽孢杆菌具有抗逆性强、稳定性好、耐氧化、耐酸碱等特点从而成为研究热点[7]。同时芽孢杆菌具有促进生长和预防疾病的作用，可作为抗生素的替代品、饲料添加剂和水质调节控制剂[8-9]。目前国内水产养殖相关研究的芽孢杆菌主要为枯草芽孢杆菌[10]、地衣芽孢杆菌[11]、蜡样芽孢杆菌[12]和凝结芽孢杆菌[13]，而赖氨酸芽孢杆菌的相关研究主要还是处于分离筛选鉴定试验中[14]，并未做相关的水产养殖验证试验。

本研究通过已筛选出的赖氨酸芽孢杆菌，以持续泼洒的方式[15]，探讨赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾的养殖水质净化效果和生长指标的影响。

1 材料与方法

1.1 赖氨酸芽孢杆菌

本实验室从广东省沿海对虾地膜精养池筛选的一株赖氨酸芽孢杆菌经过PCR 扩增产物，再经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，送至生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在NCBI上进行BLAST比对分析，以确定菌株的种类和分类地位。

利用 MEGA 7.0 软件中的基于1 000次bootstrap重复算法的neighbor-joining方法，构建系统进化树，如图1所示，可得试验菌株为赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)成员。配制浓度为0.463×109CFU/mL的赖氨酸芽孢杆菌菌液。

图1 基于16S rRNA基因序列构建的赖氨酸芽孢杆菌系统发育进化树

1.2 试验对虾及饲养管理

试验在广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地内进行，利用300 L试验桶装经过滤沉淀、含氯消毒剂消毒和曝气的天然海水250 L，放养125尾凡纳滨对虾/桶，微管曝气增氧，自然光照，试验全程采用全封闭零交换水模式。凡纳滨对虾取自广东海洋大学东海岛海洋生物研究基地，平均体长为(9.40±0.18)cm，体质量(5.18±0.13)g，附肢完整、健康、活力好。试验设1个试验组和1个对照组，每组设3个平行，量取 25 mL赖氨酸芽孢杆菌菌液，赖氨酸芽孢杆菌使用量为0.463×104CFU/mL，每隔3 d使用1次，试验10 d。投喂饵料4次/d，投喂6.25 g/次，投喂时间为07：00、11：00、15：00、19：00。

1.3 样品采集与处理

试验开始和结束时各测定一次凡纳滨对虾体长和体质量。每天14：00利用注射器抽吸法在水面下方 5.00 cm 处采集水样并测定对虾养殖水体温度、pH和盐度。

1.4 试验参数的计算方法

L=Lt-L0

(1)

W=Wt-W0

(2)

S=(St/S0)×100%

(3)

F=Ft/W

(4)

式中：L为增体长量，cm；Lt为终末体长，cm；L0为初始体长，cm；W为增体质量，g；Wt为终末体质量，g；W0为初始体质量，g；S为存活率；St为终末存活尾数；S0为初始存活尾数；F为投饲系数；Ft为投喂饲料总量。

1.5 水质指标测定方法

铵态氮含量按照(HJ 535—2009)标准采取靛酚蓝法测定[16]；亚硝酸盐氮含量按照(GB 7493—87)标准采用 N-(1-萘基)-己二胺分光光度法测定[16]；硝酸盐氮含量按照按(GB 17378.4—1998-39)标准采用锌-镉还原法测定[16]。

1.6 数据统计与分析

采用Excel软件处理数据列出变化趋势图和运用SPSS 19.0软件对数据单因素ANOVA方差分析，试验数据通过平均值+标准差表述[17]。

2 结果

2.1 赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长存活的影响

凡纳滨对虾饲养10 d后，凡纳滨对虾的体质量(体长)、存活率及投饲系数如表1所示，其中整体试验组存活率(77.07%±1.22%)与对照组存活率(71.73%±2.81%)存在显著性差异(P<0.05)，而试验组和对照组的体长(体质量)增长和投饲系数无显著性差异(P>0.05)，但试验组体长增长(0.37±0.17)cm、体质量增长(1.88±0.50)g高于对照组体长增长(0.23±0.10)cm、体质量增长(1.57±0.09)g且相比于对照组的投饲系数(1.78±0.12)，添加赖氨酸芽孢杆菌的试验组(投饲系数：1.47±0.45)能有效降低0.31。

表1 凡纳滨对虾的体质量(体长)、存活率及投饲系数

2.2 赖氨酸芽孢杆菌对水体理化因子的影响

图2 芽孢杆菌对凡纳滨对虾养殖水样的含量的影响

图3 赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾养殖水样的含量的影响

图4 赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾养殖水样的含量的影响

2.2.4 赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾养殖水样的pH的影响

图5 赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾养殖水体的pH的影响

3 讨论

3.1 赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾生长存活的影响

本试验中，添加赖氨酸芽孢杆菌试验组中凡纳滨对虾的体质量(体长)增长和投饲系数降低较对照组有差异不显著，其中试验组(A组、C组)投饲系数均低于对照组且试验组存活率显著高于对照组，这与李军亮等[18]的研究结果中相似的是添加枯草芽孢杆菌可提高凡纳滨对虾的生长性能和降低饵料系数，与刘强强等[15]的添加芽孢杆菌对凡纳滨对虾的增重率有不同程度上的提高但差异不显著以及饲料系数低于对照组的研究结果初步一致。这与芽孢杆菌的特性有关：1)芽孢杆菌能有效促进养殖对象肠道发育，增加肠黏膜的厚度、肠绒毛的高度及细胞密度，其表面抗原或代谢物担当免疫原不断刺激凡纳滨对虾的免疫防御系统，同时芽孢杆菌通过与有害细菌争夺营养和附着位点，保护机体免受病原菌的侵染，提高存活率[19-22]；2)芽孢杆菌对凡纳滨对虾养殖水体具有较好的净化的作用，给予养殖对象较好的生长环境条件[23-24]。

3.2 赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾养殖水体的铵态氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮含量的影响

3.3 赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾养殖水体的pH的影响

在养殖凡纳滨对虾的过程，凡纳滨对虾的排泄物和未完全利用的饵料等有机氮硝化过程以及芽孢杆菌以养殖水体中的有机物质作为碳源进行有氧呼吸，产生CO2[29]，都会致使水体中的pH逐渐下降，但赖氨酸芽孢杆菌的同化作用通过结合铵态氮和硝酸盐氮合成自身所需的影响[28]，促使试验组的养殖水体的pH相对于对照组下降速度更缓慢且会进行调控pH，试验组平均pH达到7.35，最低值为7.09，这与白利丹研究报告中结果相似[30]，若使pH维持在理想的范围，可以通过持续增加磷钙物或有益微生物浓度调节pH[31]。

3.4 赖氨酸芽孢杆菌的使用存在问题及解决方法

芽孢杆菌的代谢和生长容易受到环境等外界因素的变化而波动，此次试验中，赖氨酸芽孢杆菌菌液直接泼洒到养殖水体，而水体中的其他菌群可能对其代谢和生长有影响；再者养殖动物体质量大小不一，各个生长阶段的营养需求及适应条件不同[10]，水环境因素，在养殖过程中滋生大量细菌对试验的影响等等，无法控制使用最适菌液浓度，导致效果不理想。解决方法：在有限的条件下，尽量控制变量因素，挑选规格大小相同对虾，科学高效的养殖管理方式，进行多次检查试验桶，尽可能地将死虾捞出计数，避免污染水质，减小试验数据差异。在实际应用中，要想赖氨酸芽孢杆菌投入养殖水体后起到改善水质的作用，需确保水体中活菌体浓度，才会有较好的效果[32]。

4 结论

通过持续添加赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾的生长和水质初步研究表明，赖氨酸芽孢杆菌对凡纳滨对虾的生长和存活有一定的作用，同时对于养殖水质中的铵态氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、pH具有显著性的调控。赖氨酸芽孢杆菌是一种有益菌，利于养殖行业的绿色可持续发展，可以推广使用。

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