十字花科蔬菜小孢子培养研究进展

牛刘静 赵艳艳 原玉香 魏小春 杨双娟 王志勇 苏贺楠张晓伟* 尹喜恩

（1 河南省农业科学院园艺研究所，河南郑州 450008；2 鄢陵县甘罗养生养老有限公司，河南鄢陵 461200）

十字花科（Brassicaceae）植物约有375 属、3 200 种，广布于全世界，主产北温带，在我国共有95 属、425 种、124 变种和9 个变型（张振超，2012）。在众多的十字花科植物中，芸薹属和萝卜属包含了主要的蔬菜作物，在整个科中都占有极大的比重，社会需求量大，经济价值高，与人们生活有着密不可分的联系。

十字花科蔬菜常规育种方法存在育种年限长，过程繁琐费力，遗传性状不稳定等问题。小孢子培养技术是十字花科蔬菜常规育种途径的“加速版”，得到的纯合再生植株可以直接作为亲本使用，缩短育种进程，提高了培育新品种的效率。自1982年Lichter 首次在甘蓝型油菜上报道获得了小孢子再生植株后，此技术在十字花科蔬菜中均有大量报道（Hoseini et al.，2014；吴艺飞 等，2016；Bhatia et al.，2016；邓英 等，2018；贾凯 等，2018；苏贺楠 等，2018；Jia et al.，2019），且在基础应用研究中也获得了利用。育种家们利用小孢子培养技术陆续在大白菜、甘蓝、青花菜、花椰菜等国内消费市场占比较大的蔬菜上培育出多个新品种，大大加快了我国十字花科蔬菜品种的更新换代。随着小孢子培养技术在十字花科大宗蔬菜作物上取得的显著成果，以及市场生产和消费群体对多品种、高质量叶菜类蔬菜的需求，学者们对一些名优特蔬菜也进行了深入的小孢子培养研究和报道，比如高菜（张琳 等，2011）、安徽乌菜（秦艳梅 等，2017）、广州菜心（庞强强 等，2021）等。

提高小孢子培养效率，获得更多类型的DH系，可为十字花科蔬菜分子标记育种、遗传学研究、应用基础研究等提供坚实的材料基础。近年来，国内外众多学者在如何提高诱导小孢子胚胎发生形成胚，胚芽健康生长成幼苗继而获得可利用的单倍体再生植株及应用研究等方面做了大量工作。为了使小孢子培养技术的优势利用率最大化，本文就国内外十字花科蔬菜近些年来小孢子培养取得的研究进展进行综述。

1 基因型和小孢子发育时期对小孢子诱导成胚的影响

1.1 基因型

基因型是影响小孢子胚胎发生的主要内因，不同基因型材料间成胚能力差异明显（Chuong et al.，1988；Ballie et al.，1992）。在研究报道最多的白菜类蔬菜中，大白菜（李必元 等，2012）、微型大白菜（卢松 等，2015）和普通白菜（黄天虹等，2019）不同基因型供试材料虽然都获得了胚状体，但胚诱导率差异显著。陈丽潇等（2019）和付丹丹（2019）均研究发现，抗根肿病大白菜受试材基因型的影响难以出胚或者胚诱导能力低。Bhatia等（2016）研究表明，在花椰菜上小孢子诱导成胚的数量和发生能力与成熟期不同的基因型材料密切相关，晚熟材料Kt-34 产胚量最高（24.9 胚·皿-1）。姚悦梅等（2019）在羽衣甘蓝小孢子培养试验中发现，出胚多的基因型材料最后小孢子发育成子叶型胚的比例也高；而出胚量少的材料形成畸形胚数量多，子叶型胚数量减少。Daria 等（2020）研究证实，芜菁的小孢子胚胎发生能力同样在很大程度上依赖于基因型，并且在初期胚胎启动发生过程中次生胚的产生数量会直接影响双单倍体植株的数量。在萝卜小孢子培养上，张丽等（2020）对2 份水果萝卜（肉色血红）进行小孢子诱导，成胚率分别为15.6%和21.3%。

对于出胚率低或不能获得胚状体的材料，学者们也一直在尝试新的解决办法来降低基因型的受限程度。利用种间杂交种进行小孢子培养来克服此难题是目前报道较多的途径（李栒 等，2003；李勤菲，2010；Zeng et al.，2015）。贾俊香（2019）以普通白菜（青梗菜）和菜薹（菜心）杂交F1为试材获得了203 份多头、叶色油亮的纯合菜心材料；利用紫叶青梗菜和菜心杂交，得到122 份紫叶菜心DH材料，在改善菜心出胚率低的基础上，还创制出新的育种亲本材料。此外，李楠（2018）将不易出胚的甘蓝材料小孢子置于适量的诱导培养基中进行单花蕾悬浮培养，可经游离小孢子胚发育途径发育成胚，最高可达10 胚·蕾-1，表明此诱导成胚途径具有可行性。综上可知，十字花科蔬菜作物不同类型试材间几乎都受到基因型的影响。基因型不仅影响胚胎发生的效率，而且也影响胚状体的质量（Chuong et al.，1988）。

1.2 小孢子发育时期

供体植株的栽培方式、生长环境、花蕾大小、取材时期和部位等都会影响小孢子生理状态。而胚状体产生的数量在一定程度上与不同发育时期的小孢子状态是密不可分的。通常小孢子发育时期分为四分体、单核早期、单核中期、单核靠边期、双核期和三核期。前人研究表明，胚胎发生的启动大部分都处于单核靠边期和双核期这一短暂过程中，又被称为胚状体发生的窗口期（余凤群，1994；姜立荣 等，1996）。

准确、快速选择出适宜的试材培养时期，可减少小孢子培养前期的工作量，保证试验材料在小孢子培养过程中的产胚有效性。唐兵等（2017）研究发现，当大白菜花蕾中单核靠边期的小孢子占比低于50%时，几乎不能诱导出胚芽，而高于80%时产胚量大幅度提高，最高为77.20 胚·蕾-1；且盛花期是小孢子胚诱导的最佳时期。苏贺楠等（2018）研究表明，当结球甘蓝的花蕾长度为3.0～3.5 mm、花药长∶花瓣长为2/1～3/2 时，处于单核靠边期的小孢子占比为67%～71%，有利于小孢子诱导出胚；初花期和盛花期均是进行小孢子培养的适宜取材时期。在萝卜（李丹 等，2008）、青花菜（王春丽 等，2010）、新疆芜菁（贾凯 等，2018）、乌塌菜（黄心乌）（郭靖，2019）、菜薹（菜心）（庞强强 等，2019）和普通白菜（小白菜）（杨延红 等，2020）上的研究均得出单核靠边期为小孢子培养的适宜取材时期。虽然小孢子发育时期可以参考花蕾大小、花瓣长与花药长比值等指标来判断，但也会随供体植株的基因型、栽培环境条件、株龄和花序生长等因素的变化而有所改变（张振超，2012）。

2 影响小孢子胚状体诱导成功的外因

2.1 培养基蔗糖浓度

培养基成分对组织培养试验而言，在很大程度上是决定能否诱导成功的关键。培养基中的基础成分蔗糖具有提供必需营养物质和调节细胞渗透压的双重作用。通常十字花科芸薹属蔬菜小孢子培养使用的蔗糖浓度为13%，也有少数研究认为高于或低于此浓度时也能诱导出胚芽，且在培养过程中不同时期更换蔗糖浓度对某些基因型材料而言出胚效果更佳（Shumilina et al.，2015；付丹丹，2019；杨易等，2020）。在芸薹属蔬菜小孢子培养中，培养基蔗糖的使用浓度因材料基因型而异，采用适宜的浓度往往能获得良好的试验结果。

2.2 培养基生长调节剂

许多研究均表明，6-BA、NAA 和2，4-D 等在十字花科芸薹属蔬菜小孢子诱导成胚及胚状体顺利生长为再生苗，至最终形成健壮双单倍体植株培养中都具有重要作用。赵艳艳等（2020）研究表明，添加0.05 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA 可显著提高菜薹（菜心）出胚率。李智军等（2021）研究表明，2，4-D 对芥蓝小孢子成胚率的影响因基因型而异；使用不同浓度的2，4-D 会产生不同类型的胚状体如子叶胚、球形胚和鱼雷胚等，直接影响胚状体的数量和质量；添加2，4-D 对芥蓝品种顺宝2 号的小孢子启动分裂无显著影响，但可维持或提高已分裂细胞的再分裂能力，降低中途退化或败育概率，从而提高胚产量。

2.3 其他添加物的应用

汪维红等（2010）研究发现，使用0.2%正丁醇预处理5 h 可显著提高乌塌菜（黄心乌）的出胚率。付丹丹（2019）研究表明，在培养基中添加150 mg·L-1或200 mg·L-1NaCl 显著提高了抗根肿病大白菜的胚诱导率。培养基中添加10 mg·L-1AG（阿拉伯半乳聚糖）和10 mg·L-1AGP（阿拉伯半乳糖蛋白）可显著提高耐抽薹大白菜、普通白菜（王爱杰，2012）和结球甘蓝（曾爱松 等，2015）胚芽诱导率。在NLN 液体培养基中添加0.1～0.2 mg·L-1BR 可使普通白菜胚诱导率提高2.05～6.39 倍（Jia et al.，2019）。头孢噻胯对普通白菜的胚诱导率因基因型不同而有所差异，促进或抑制作用因不同试材而反应不同（黄天虹 等，2019）。

有学者还在小孢子诱导培养基中添加一些酸性物质来提高难出胚材料的胚诱导发生能力。Yuan等（2012）研究表明，添加适量浓度的2-吗啉乙磺酸（MES）对结球甘蓝胚诱导率有提高效果；在pH 值为6.4 的NLN-13 培养基中添加10 mg·L-1AGP 和3 mmol·L-1MES，出胚数量可达到4.57～222.97 胚·蕾-1，尤其是对难出胚材料中甘8号而言，胚诱导率提高了约35 倍。脱落酸、茉莉酸、水杨酸（Ahmadi et al.，2014）和抗坏血酸（Hoseini et al.，2014）对甘蓝型油菜的小孢子胚诱导也起着积极作用。此外，Gao 等（2020）研究表明，非离子表面活性剂对不易诱导成功的紫菜薹小孢子胚状体诱导和植株再生均有显著的促进作用。

3 胚芽转化成苗的影响因素

3.1 琼脂浓度

在获得一定数量的胚状体后，如何保证胚芽生长发育成为健康可利用的再生植株是小孢子培养技术中的另一关键环节。继代培养基中的琼脂浓度和培养基含水量均会直接影响胚芽的生长情况，水分多、湿度大会导致再生植株出现玻璃化或者褐化现象。Peng 等（1994）发现培养基中添加1.6%琼脂时所产生的压强是3～4 kPa，最有利于小孢子向胚芽途径生长转化，表明培养基中的渗透压加快了胚芽转化成苗的进程。之后，Takahashi 等（2012）在白菜类作物5 个亚种上的试验结果表明，与0.8%琼脂浓度相比，B5 培养基中使用1.6%琼脂可使胚芽转化再生植株的能力提高4～8 倍。但是不同种类的十字花科蔬菜作物所需的压强不同。庞强强等（2021）在菜薹（菜心）小孢子胚再生体系优化研究中得出，B5 培养基中琼脂浓度为1.0%时出苗率最高。姚悦梅等（2019）研究表明，1.2%琼脂浓度的B5 培养基更有利于羽衣甘蓝子叶型胚状体的增殖分化成苗。

3.2 胚龄

胚龄是指小孢子及胚状体在液体培养基中生长的天数（刘环环，2014）。将适宜胚龄的胚状体转接至固体培养基中生长发育对保证胚状体的直接成苗率至关重要。不同芸薹属蔬菜作物对胚龄的要求有所差异。在菜薹（菜心）（庞强强 等，2021）和羽衣甘蓝（戴希刚 等，2013）上，25～30 d 是小孢子胚再生成苗适宜的胚龄，胚龄40 d 以上的基本不出苗。对于青花菜和结球甘蓝而言，较长的胚龄（30～35 d）能使胚状体再生成苗率显著提高，可达75%以上（王涛涛 等，2009）。胚龄为25 d的新疆芜菁小孢子子叶型胚转接至固体培养基后成活率最高，可达66.67%（贾凯 等，2018）。红菜薹小孢子培养中转接胚龄控制在15～25 d 时，成苗率为65%～83%（吴艺飞 等，2016）；但也有学者得出红菜薹胚状体再生成苗的最适胚龄是20～29 d（王涛涛 等，2009）。综上可知，随着胚龄的不断增长，胚状体的成活率和成苗率均会逐渐降低。

4 小孢子再生植株的倍性鉴定和加倍方式

4.1 倍性鉴定方法

王涛涛等（2009）研究发现，在多种十字花科芸薹属蔬菜作物中均存在不同比例的单倍体、二倍体、多倍体及嵌合体混合再生植株。快速鉴定出小孢子再生植株的倍性水平有助于提高DH 系材料的利用率，也是小孢子培养技术研究的重要部分，且对于育种工作效率和实际应用生产更是尤为重要。传统的倍性鉴定方法主要有植株形态法（包括植株长势、叶色叶形、花器官形态、角果形态等）、细胞形态法（包括气孔大小、保卫细胞叶绿体数目、花粉粒大小和形态等）和染色体计数法（包括根尖染色体、体细胞染色体和花粉母细胞染色体）（张振超 等，2014）。随着科技快速发展和分子标记技术的日趋成熟，流式细胞术鉴定法、分子标记鉴定法、同工酶鉴定法和生理生化指标鉴定法也成为判断植株倍性水平的方法和重要辅助手段（陆晓媚等，2022）。

再生植株的精准倍性鉴定常通过染色体计数法和流式细胞仪来确定（Maluszynska，2003；Ochatt.，2008）。染色体计数法是一种最直接且准确的鉴定方法，但操作过程繁琐、耗时长，鉴定效率低，不适宜大规模筛选倍性材料。利用流式细胞仪鉴定植株倍性，具有样品制备方便、分析快速、准确性高、所需样品量少及可测样品数量多等优点，已成为越来越受欢迎的倍性检测方法，唯一缺点是检测成本高。流式细胞仪鉴定植株倍性在十字花科蔬菜作物中已得到广泛应用（王春丽 等，2010；贾凯 等，2018；Gao et al.，2020；庞强强 等，2021）。而植株形态法、分子标记鉴定法、同工酶鉴定法和生理生化指标鉴定法只可作为初步判断植株倍性的一种辅助技术手段，由于准确度不高，根据试验目的还需对筛选出来的单倍体或多倍体植株采用流式细胞仪进行更精准的倍性水平鉴定。

由于染色体计数法具有不能大规模鉴定植株倍性水平的局限性和流式细胞仪检测费用高的缺点，在实际试验过程中大多会在植株生长早期阶段应用植株形态法来初步判断植株倍性，减少冗余工作量，提高倍性鉴定效率。还有学者以流式细胞仪鉴定结果为依据对再生植株叶片气孔保卫细胞叶绿体数目和大小进行研究，得出气孔保卫细胞叶绿体数目是判断小孢子再生植株倍性的简易有效手段，如甘蓝、芜菁（祁魏峥 等，2015；贾凯 等，2018）。

4.2 自然加倍

通过小孢子培养获得的再生植株会发生不同程度的自然加倍现象。有研究表明，小孢子胚自然加倍与胚胎发生初期的核内有丝分裂有关，推测在胚诱导初期就已经完成自然加倍（Keller &Armstrong，1981；李菲，2006）。除受基因型影响外，培养条件和处理方法都会影响小孢子自然加倍频率（Zhao et al.，1996）。不同芸薹属蔬菜作物的自然加倍频率差异明显。大白菜的小孢子再生植株自然加倍率超过70%（Zhang &Takahata，2001）；通过小孢子培养的银玉白萝卜再生植株自然加倍率高达82.21%，其中双单倍体率为44.17%（张丽等，2016）；在菜薹（菜心）小孢子培养再生植株中，3 个基因型材料经自然加倍的二倍体植株率在62.22%～71.11%之间（庞强强 等，2021）；经小孢子培养获得的芜菁甘蓝再生植株自然加倍率较低，为21.70%（赵艳艳 等，2021）；芥菜小孢子培养再生植株自然加倍率更低，仅为4%～6%（Prem et al.，2008）。此外，皮明雪等（2020）通过改变光照条件和低温处理来提高甘蓝型油菜小孢子培养再生植株的自然加倍率，获得了1 个胚产量（119.87胚·蕾-1）和自然加倍率（79.87%）均很高的DH系；并证实了光照对一次成苗率和再生植株加倍率并无影响，但基因型对其影响较大，不同基因型材料间自然加倍率可相差2～3 倍。

4.3 人工诱导加倍

部分十字花科蔬菜通过小孢子培养获得高频率的单倍体再生植株，无法直接应用到基础育种工作中。因此，对于自然加倍率低的小孢子再生植株，进行人工诱导染色体加倍是必要的环节。体细胞染色体加倍可发生在分生组织细胞、薄壁细胞、幼胚或合子中，分生组织细胞和薄壁细胞加倍易导致产生嵌合体，幼胚或合子加倍则容易产生多倍体孢子体（张振超，2012）。

目前报道最多、应用效果较好的诱导剂是秋水仙素，诱导发生加倍的主要作用机制是在细胞分裂时抑制纺锤丝的形成，染色单体分裂但细胞质不发生分离，最终导致染色体数目加倍（周广芳，1991）。通过化学药剂处理小孢子细胞和再生植株幼苗均能加倍成功。万丽丽等（2020）对3 个油菜F1的小孢子细胞采用85 mg·L-1秋水仙碱处理后得到的DH 系植株最多。甘蓝型油菜小孢子再生植株转至含有80 mg·L-1秋水仙碱的MS 培养基中培养，最高加倍率为43.47%，且成苗率可达到76.67%（谭少敏 等，2015）。为了提高再生植株的加倍成功率，还有学者在小孢子培养过程中先将小孢子细胞用秋水仙碱处理1 次，使一部分小孢子加倍，待再生植株移栽至大田后，在现蕾抽薹期对具有明显单倍体特征的植株用0.2%秋水仙素 +0.1%二甲基亚砜混合溶液注射至植株下部的分枝腋芽中，加倍率由之前的35.8%～66.4%提高到了61.3%～80.4%（李书宇 等，2018）。

5 应用研究

5.1 在抗病抗逆方面

培育抗病、抗逆性强且优质高产品种是十字花科蔬菜的主要育种目标。常见的病害对十字花科蔬菜的品质、产量和种植面积均有重大影响，有些土传病害如根肿病、枯萎病等通过传统的化学方法和农艺措施已很难控制，应用抗病、抗逆品种是克服病害最直接有效的途径（Farnham et al.，2001）。吴安平（2008）应用小孢子培养技术从构建的DH 系群体中经抗寒性鉴定筛选出28 份抗寒性极强的DH系种质资源。Lv 等（2014）采用高抗枯萎病（96-100）和易感枯萎病（01-20）的两个结球甘蓝自交系进行小孢子培养，从获得的196 个DH 群体中通过农艺性状鉴定和分子标记辅助选育技术筛选出3个优异DH 系材料，并与已有的优良自交系杂交，对其抗病性和农艺性状评估后得到3 个高抗枯萎病的优良组合。Li 等（2020）利用同样的方法从230份结球甘蓝DH 群体中筛选出4 个优异DH 系与甘蓝自交系杂交，从逾60 份杂交种中筛选出5 份高抗裂球和枯萎病的材料，且在大田种植中表现出良好的农艺性状。Liu 等（2019）以甘蓝小孢子培养获得的抗病DH 系材料D134 为抗性供体亲本，结合背景筛选通过回交方式将枯萎病抗性基因成功转育到骨干亲本中，获得1 份高抗枯萎病的亲本材料，已成功应用到培育抗病品种的研究中。陈丽潇等（2019）采用10 个抗根肿病大白菜品种进行小孢子培养，从获得的40 株DH 植株中利用根肿病抗性基因CRa的特异性分子标记筛选出27 株携带抗性基因的DH 植株。小孢子培养技术和现代分子标记辅助选择方法的结合应用大大缩短了获得具有抗病性优异杂交种材料的时间，将直接提高十字花科芸薹属蔬菜作物新品种培育的工作效率。

目前为止，虽未见利用小孢子培养技术育成萝卜新品种的相关报道，但张丽等（2020）应用此技术有效解决了心里美萝卜（血红肉）在常规自交中出现的浅绿肉变异株问题，这为萝卜基础应用育种工作提供了参考。

5.2 在基因定位方面

小孢子培养获得的DH 系群体是识别分子标记和构建遗传基因图谱的理想材料（Kitashiba et al.，2016；Liu et al.，2017；Valdés et al.，2018）。Kitashiba 等（2016）在芜菁小孢子培养过程中通过偏分离分析确定了3 个与胚产量相关的基因位点，并证实了它们对胚产量的遗传影响。Lv 等（2014）利用DH 群体和F2分离群体，将甘蓝枯萎病抗性基因FOC1精细定位于C06 染色体84 kb 区间内。Su 等（2015）利用甘蓝DH 群体构建了基于SSR和InDels 标记的高密度遗传连锁图谱，并对耐裂球性状进行QTL 定位。王会等（2014）基于甘蓝型油菜DH 群体对抗裂角性的遗传研究表明，抗裂角性主要受3 对主基因+多基因控制，且主基因遗传率大于85.00%，其他微效基因和环境因子的影响较小。Song 等（2021）对生长在3 种不同环境条件下甘蓝型油菜DH 群体的开花时间进行QTL 定位，发现了2 个主效QTLs，在半冬性油菜生长区检测到1 个主效QTL 位于A03 染色体上，在3 种不同生长环境下的甘蓝型油菜中均检测到C08 染色体上的1 个主效QTL，并对QTL 内的差异表达基因进行分析，获得4 个与开花时间相关的候选基因。安谈洲（2021）对甘蓝型油菜分枝数和腋芽数有差异的两个育种亲本构建的DH 群体进行QTL扫描，发现一次分枝数的QTL 有5 个，腋芽数的QTL 有6 个。

5.3 在突变体筛选方面

创制丰富的突变体材料是试验研究和品种改良的重要途径之一。Huang 等（2016）利用0.12%EMS（V/V）溶液处理大白菜小孢子10 min 后转移至NLN-13 液体培养基中，最终从1 304 份再生植株中获得6 株具有稳定遗传性状的突变体植株，为克隆有利突变基因、植物育种和功能基因组学研究提供了材料基础。使用雄性不育系获得杂交种是利用杂种优势的一种重要途径。谭翀（2018）应用小孢子培养技术和60Co γ-射线诱变结合的方法从大白菜FT DH 系中创制出1 份稳定遗传的雄性不育突变体，命名为ftms。此后，Huang 等（2020）采用同样的方法也获得了1 份雄性不育突变体（msm）材料，除雄蕊发育情况不同外，大白菜FT 和msm的遗传背景高度一致，成功创制出的突变体是研究大白菜雄蕊发育分子机制的理想材料。

5.4 在新品种培育方面

传统育种方法是通过多年系统选育获得稳定的胞质雄性不育系、自交系及自交不亲和系作为亲本，培育出多种类型的十字花科蔬菜新品种，但亲本纯化时间长、育种成本高、受环境因素影响也较大。随着十字花科蔬菜小孢子培养技术体系的不断改进和成熟，近年来多家研究院所利用此技术获得了大量优异纯合的DH 系新种质，通过田间株系间杂交、回交和自交等常规育种技术及分子标记辅助选育手段相结合的方法，创制出一批聚合多个优良性状的育种材料，培育出多个满足生产和市场需求的不同成熟期、不同产品类型且抗病抗逆性强的新品种。

我国最早利用游离小孢子培养技术成功培育出十字花科蔬菜新品种的育种单位是河南省农业科学院叶类蔬菜生物育种创新团队，率先建立了一套完善的大白菜游离小孢子培养体系（栗根义 等，1993），在育成第1 个大白菜品种豫白菜7 号（豫园1 号）（栗根义 等，1998）后，又培育出豫园、豫新系列大白菜新品种（栗根义 等，1999；耿建峰 等，2002，2003；张晓伟 等，2002a，2002b，2004；原玉香 等，2004；蒋武生 等，2005；姚秋菊 等，2008a，2008b）；此后，又将该技术应用于甘蓝育种，快速培育出国内第1 个利用游离小孢子培养技术选育的甘蓝新品种—豫生1 号（张晓伟等，2001），之后又育成豫生和豫甘系列甘蓝新品种（张晓伟 等，2008a，2008b；姚秋菊 等，2015；张晓伟和姚秋菊，2016），已规模化应用到生产实践中，推广种植面积大，市场经济效益显著增加。

随后，国内其他科研院所及学校利用游离小孢子培养技术也相继培育出大白菜、甘蓝、青花菜和花椰菜等十字花科蔬菜新品种，例如苗球兼用型的早熟8 号（胡齐赞 等，2008），耐贮运、高抗根肿病的CCR11242（徐学忠 等，2015），早熟、耐抽薹性强的秦春3 号（赵利民 等，2019）及长筒青麻叶类型的珍绿60（闻凤英 等，2017）等大白菜新品种；早熟，耐抽薹、耐裂球性强，高抗病毒病、霜霉病、黑腐病和干烧心的秦甘58（张恩慧，科技成果），耐先期抽薹、高抗枯萎病的YR 中甘21（吕红豪 等，2021）和适宜密植的张甘60（申领艳 等，2021）等甘蓝新品种；春秋兼用型、抗黑腐病和霜霉病的领秀2 号（刘莉莉 等，2018），晚熟、适宜密植、综合抗性良好的浙青95（王建升等，2018）和早熟性突出的浙青60（王建升 等，2020）等青花菜新品种；耐热，高抗软腐病、黑腐病和菌核病的松花55 天（陈文辉 等，2011），中熟、适用于脱水加工的浙801 和浙017（顾宏辉 等，2011，2012），耐热、耐湿的优松68（单晓政 等，2021）等花椰菜新品种。这些具有综合优良性状的抗病抗逆新品种有效降低了生产过程中病害的发生情况，生产成本降低，经济效益明显提高。此外，广东省农业科学院蔬菜研究所在芥蓝新品种培育中，利用小孢子培养技术快速纯化亲本，采用雄性不育系或自交不亲和系选育出了抗逆性强、丰产性好、品质优良的芥蓝一代杂种（陈汉才 等，科技成果）。

6 展望

近年来，通过对小孢子培养技术体系的不断优化，此技术在十字花科蔬菜基础研究和育种应用中发挥着愈来愈重要的作用。多种十字花科蔬菜都获得了一定数量的优良纯系种质资源，并成功应用于育种实践中，但萝卜、菜薹（菜心）的小孢子诱导成功率仍然较低，主要受基因型制约。有报道称，热激处理导致生长素以极性方式存在于小孢子中，从而促使了小孢子胚胎发生的启动，诱导小孢子从配子体转至胚胎发育过程，但并非所有的基因型都能诱导成功（Dubas et al.，2014；Zhang et al.，2020）。对此，还需进一步研究探索出新方法来克服，提高优异育种材料的出胚率和双单倍体植株成苗数量，提高小孢子培养技术的优势利用率。研究小孢子胚胎发生过程可以更好地了解合子胚发生过程，但迄今为止对于小孢子胚胎发生的分子机理研究仍不透彻。

多数学者利用小孢子培养技术创建了十字花科不同蔬菜种类的DH 群体，从中筛选出抗病抗逆性强、可供育种研究利用的雄性不育系突变体材料，同时通过基因定位挖掘出一些在小孢子胚胎发生过程中的相关基因及遗传育种中重要性状的分子标记，可以加快十字花科蔬菜作物重要农艺性状关键基因的克隆。小孢子培养技术和分子标记辅助选择方法相辅相成来开展十字花科蔬菜基础应用研究和深入的遗传学育种研究，可以使小孢子胚胎发生、诱导胚状体直接成苗及再生植株自然加倍等3 个关键环节进行改良的同时，快速获得更多优异的种质资源。