布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白生物信息预测

薄雅宁，庄添瑞，高 玥，孙靖楠，胡 海，王 锐，高志祥，于 慧*

（1.包头医学院乌兰察布临床医学院；2.包头医学院公共卫生学院；3.包头医学院中医学院；4.包头医学院口腔医学院；5.包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古 包头 014040；6.内蒙古自治区人民医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010010）

布鲁氏菌（Brucella）是一种胞内寄生革兰氏阴性菌，布鲁氏菌所致的布鲁氏菌病为一种人畜共患病。布鲁氏菌的自然宿主以牛、羊等家畜以及人类为主。感染会导致家畜的睾丸炎、流产或不孕不育；人感染后引发波状热，临床并发心内膜炎、肝脾肿大、关节病变或骨髓增生等，以生殖系统疾病为多[1]。随着研究不断进展，根据宿主偏好性和生化表型对布鲁氏菌的分类也越来越多，但是人类对于防治布鲁氏菌依然没有效果较为理想的疫苗。

外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMP）是一种仅存在于革兰氏阴性菌中的特殊蛋白质，通常具有一个跨膜结构域，位于细菌外膜，该跨膜结构域是细菌存活和毒力发挥的关键因素，主要包括OmpA、OmpW等[2]。由于布鲁氏菌的外膜蛋白具有较强的免疫原性，所以布鲁氏菌可以逃避巨噬细胞的免疫监控与反应。细胞死亡分析显示，T4SS效应VceC和两个不同的分泌蛋白OmpW家族蛋白（BAB1_1579和蛋白BAB1_1185）与布鲁氏菌细胞毒性有关。这项研究提出对于布鲁氏菌细胞毒性相关的分子机制新的见解和为布鲁氏菌筛选候选疫苗的筛选提供有价值的信息[3]。

对布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白进行生物信息学分析，可以进一步了解OmpW家族蛋白基因表达、蛋白质特性、蛋白质结构功能、免疫学特性等相关信息，为日后深入研究其作用提供更多理论依据，也为研发更加安全有效的布鲁氏菌疫苗和临床治疗药物提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

从NCBI-Gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）基因数据库找到不同种布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因序列和蛋白质氨基酸序列。

1.1 蛋白质理化性质分析运用在线分析工具ProtPararm （https://web.expasy.org/protparam/）分析布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的一些物理和化学参数，如氨基酸和原子组成、正负电荷残基数、分子量、等电点、分子式、半衰期、不稳定系数、脂肪族指数、亲水性系数等。

1.2 蛋白质跨膜结构域及信号肽预测运用TMHMM预测布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的跨膜结构域；使用novopro网站（https://novopro.cn/tools/signalp）预测布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的信号肽。

1.3 蛋白质的糖基化及磷酸化位点预测通过NetPhos3.1 （https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）预测布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白磷酸化作用位点，采用NetNGlyc1.0在线分析布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白糖基化作用位点。

1.4 蛋白质二级结构预测通过UCL（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）在线分析工具预测布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的二级结构。

1.5 蛋白质的三级结构预测及建模利用在线软件SWIWW-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive/GBJVfy/models/）预测并建立布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的三级结构模型。

1.6 B、T细胞抗原表位预测通过ABCPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）预测布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的B细胞抗原表位；通过NetMHCcons-1.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCcons-1.1）预测该蛋白的T细胞抗原表位。

2 结果

2.1 不同种布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因序列从NCBI-Gene数据库中获得马耳他氏布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌、流产布鲁氏菌、中间型布鲁氏菌中外膜蛋白OmpW家族蛋白基因序列，见表1。

表1 各类布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因ID

以上6种布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白基因一致，共有684个碱基，基因序列NCBI-Gene基因数据库中可查询。

2.2 OmpW家族蛋白的氨基酸序列OmpW家族蛋白基因编码蛋白共含有227个氨基酸残基，见表2。

表2 各氨基酸比例数目

2.3 OmpW家族蛋白的理化性质ProtPararm在线分析工具分析布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白理化性质。布鲁氏菌外膜蛋白OmpW分子式为C1136H1717N281O321，脂肪族指数为91.63，理论pI值为5.67，原子总数为3 457，其氨基酸序列Ala（A）占12.3%、Gly（G）占10.6%。正电荷残基（Arg+Lys）、负电荷残基（Asp+Glu）总数分别为16和18，其不稳定系数为23.01。该蛋白为稳定蛋白，亲水性系数为GRAVY为0.143。体外哺乳动物的网织红细胞半衰期是30 h，酵母体内半衰期为＞20 h，大肠杆菌体内半衰期＞10 h。

2.4 OmpW家族蛋白的跨膜结构域及信号肽预测经过TMHMM Server v.2.0对于布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白进行跨膜结构域预测，结果显示在其7～29位氨基酸处存在有一个跨膜结构域，见图1。

图1 跨膜结构域预测

经novopro网站进行OmpW蛋白信号肽预测，结果显示有信号肽的概率为：96.481%，信号肽类型：SP（Sec/SPI）；切割位点：26～27，概率：97.400%。

2.5 OmpW家族蛋白的糖基化和磷酸化分析经过NetPhos3.1进行布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白磷酸化位点预测。发现存在17个磷酸化位点，分别位于第15、87、98、132、148、156、209、221、224位苏氨酸（T）；位于第61、72、100位酪氨酸（Y）；位于第43、66、68、73、108位丝氨酸（S）等氨基酸处（见图3）；并存在1个N-糖基化位点，位于第146位（0.6939）氨基酸处（见图4）；没有发现存在O-糖基化位点。

图3 磷酸化位点

图4 糖基化位点

2.6 OmpW家族蛋白的二级结构预测布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的二级结构中有链（Strand）13个，螺旋（Holix）2个，卷曲（Coil）16个，见图5、图6。

图5 二级结构预测

图6 二级结构预测

信号肽序列：MPWMNRFARGLLAATALTFAAPAAFA，见图2。

图2 信号肽预测

2.7 OmpW家族蛋白的三级结构预测利用在线软件SWIWW-MODEL预测并建立布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白的三级结构模型。其GMQW值为0.52，说明结果可信度高，预测OmpW家族蛋白为单聚体，属于外膜蛋白家族，见图7。

图7 三级结构预测

2.8 OmpW家族蛋白的T、B细胞抗原表位预测通 过ABCPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/）预测蛋白共有2 4个B细胞抗原表位，如2 0 4-219，66-81，144-159，78-93，169-184，35-50等。通过NetMHCcons-1.1（https://services.healthtech.dtu.dk/service. php?NetMHCcons-1.1）预测蛋白的T细胞抗原表位（HLA-A*02:01），预测结果强结合肽4个，弱结合肽5个。

3 讨论

革兰氏阴性菌的外膜（outer membrane，OM）外部小叶存在脂多糖，因此是一种保护性屏障，能阻碍亲水性和疏水性化合物的渗透。OMP是促进革兰氏阴性菌摄取细胞生长和功能所必需的营养和其他分子的通道之一[4]，是一种革兰氏阴性菌中的特殊蛋白质，通常具有一个跨膜结构域，是细菌存活和毒力发挥的关键，主要包括OmpA、OmpW等[2]。而外膜蛋白W（OmpW）属于小外膜孔蛋白家族，由8股反向平行β折叠片形成的桶状疏水通道[5]，相关研究表明OmpW家族蛋白与提高细菌应对各种环境压力的能力紧密相关，如渗透作用[6]、氧化作用[7]、温度变化及营养匮乏[8]等。同时，OmpW家族蛋白作为一种毒力因子编码的蛋白，其在细菌体内合成增多通常表示细菌毒力的加强，可视为是一种重要的保护性抗原[9]，由于其在革兰氏阴性菌中具有较高的保守性，在病菌感染和宿主免疫反应的激活方面起重要作用，应成为疫苗研发的重点关注对象。目前，关于大肠杆菌OmpW家族蛋白基因的研究较多，而对于布鲁氏杆菌OmpW基因鲜有报道。有研究表明，布鲁氏菌外膜蛋白免疫原性较好，可以刺激机体产生较强的免疫，可作为疫苗构建的候选物[10]，鉴于此，本研究对其进行生物信息学分析，以期为进一步研究布鲁氏杆菌的疫苗研发提供理论 依据。

布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白分子式为C1136H1717N281O321，脂肪族指数为91.63，理论pI值为5.67，原子总数为3457，其氨基酸序列Ala（A）占12.3%，Gly（G）占10.6%。Arg+Lys、Asp+Glu总数分别为16和18，其不稳定系数为23.01，可以认为布鲁氏杆菌外膜蛋白OmpW家族蛋白具有较好的稳定性。本研究发现，在该蛋白7～29位氨基酸处存在有一个跨膜结构域。本研究预测该蛋白在细胞中起着通道蛋白的作用。该蛋白有96.481%的概率存在信号肽，信号肽指引蛋白质转移的方式有两种，转运后由三种信号肽酶进行切除，该蛋白存在的信号肽为常规的分泌通路和Ⅰ型信号肽酶。

蛋白质的磷酸化修饰与多种生物学过程密切相关，如DNA损伤修复、转录调节、信号转导、细胞凋亡的调节等。布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白存在17个磷酸化位点，存在1个N-糖基化位点，没有发现存在O-糖基化位点。该预测为进一步解析OmpW家族蛋白磷酸化在调控布鲁氏菌转录与复制过程中的作用奠定基础。

通过分析布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族的二级结构可以发现其折叠比例最高，蛋白质折叠机制一直是一项研究热点，蛋白质的错误折叠可能导致新生肽链的降解或蛋白活性的消失，因此，我们猜测诱导布鲁氏杆菌OmpW家族的错误折叠可以破坏其稳定性，降低杀死此菌的难度。

抗原表位的研究，拥有重要的意义和临床应用价值。预测显示布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族共有24个B细胞抗原表位，T细胞抗原表位（HLA-A×02∶01）有强结合肽4个，弱结合肽5个。该蛋白抗原表位较多，有一定的抗原性，可以作为潜在的布鲁氏菌感染抗原候选分子，为研发布病新药靶点及新型疫苗制备提供新的方向。

通过上述研究，我们有效实现了布鲁氏外膜蛋白OmpW家族蛋白生物信息的预测分析。该蛋白质由227个氨基酸残基组成，原子总数为3 457，等电点为5.67，整体表现为非亲水性的稳定蛋白；该蛋白存在1个跨膜结构域；含有1个N-糖基化和17个磷酸化修饰位点； 二级结构中有链（Strand）13个、螺旋（Holix）2个、卷曲（Coil）16个。以上研究表明布鲁氏菌外膜蛋白OmpW家族蛋白在细菌感染和宿主免疫反应的激活方面有着重要作用，为深入解析OmpW家族蛋白在布鲁氏菌在侵染过程中发挥的作用及研发更加安全有效的布鲁氏菌疫苗和临床治疗药物提供了一定理论基础。