油樟叶水提物化学成分分离鉴定和抗肝癌活性研究

周文娟， 邱远望， 贝佳炎， 王煜洲， 阮诗琪， 倪 林,3*

(1.福建农林大学 生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建 福州 350002； 2.福建中益制药有限公司，福建 泉州 362700； 3.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002)

油樟隶属樟科樟属，为我国特有树种[1]，主要分布于长江以南地区，近年来在福建有大规模种植。福建龙岩、三明等地油樟人工林种植面积达5万亩，植物资源丰富。油樟枝叶是生产以1，8-桉叶油素为主成分精油的主要原料，常采用水中蒸馏的方式进行提取，其间需要利用大量的水，每年产生的油樟水提液可达5万吨，对资源造成严重浪费。如何科学、有效地利用水提液成为了油樟产业发展亟待解决的关键科学问题。油樟枝叶除精油外，还含有大量的酚酸类、黄酮类、苷类、甾体、三萜、香豆素等成分[2-4]，具有良好的抑菌、抗炎、抗氧化等[5-7]生物活性，深入系统的化学成分研究有望为水提物的利用和开发寻找到新途径。因此，本研究对油樟水提物的化学成分进行分离、纯化和鉴定，并对化合物进行抗肝癌活性测试，以期为油樟水提物的化学利用提供科学依据。

1 实 验

1.1 原料、试剂与仪器

油樟叶样品，于2019年7月采自福建连城油樟种植基地三年生油樟叶(东经116°73′，北纬25°72′)，经福建农林大学邹双全教授鉴定为樟科樟属油樟(Cinnamomumlongepaniculatum(Gamble) N. Chao ex H.W.Li)，植物标本(No. 20200922)留存于福建农林大学植物保护学院农药与制药工程系。

D101大孔吸附树脂，郑州和成新材料科技有限公司；GF254薄层层析硅胶、柱色谱硅胶，青岛海洋化工有限公司；Sephadex LH-20凝胶，美国通气电力公司；PRP-512A树脂，北京聚福树脂厂。甲醇、乙腈，色谱纯；甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、氘代二甲亚砜和氘代氯仿等试剂，均为市售分析纯。5-氟尿嘧啶(5-Fu)，Sigma公司；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)，江苏凯基生物技术股份有限公司；HepG2肝癌细胞，上海细胞微生物研究所。

球形真空浓缩罐；TQ系列多功能提取罐，厦门百盛捷自动化设备有限公司；Bruker AV400(400 MHz)核磁共振仪，德国布鲁克公司；Waters W2695-QDA 高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)仪，美国Waters公司；LC-20AP制备型高效液相色谱(HPLC)仪，日本岛津公司；Bio Tek酶标仪，美国博腾仪器有限公司。

1.2 提取分离

阴干切碎的1～3 cm油樟叶小段100.0 kg，投入多功能提取罐，加入8 t蒸馏水，100 ℃水蒸气蒸馏提取3 h，水提液经大孔吸附树脂吸附、洗脱，减压浓缩得1.8 kg浸膏。取1.4 kg浸膏经甲醇溶解后，与4.4 kg硅藻土拌样，依次用石油醚、乙酸乙酯和乙醇萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取相(64.96 g)，乙酸乙酯萃取相(404.48 g)，乙醇萃取相(528.95 g)。

取乙酸乙酯部位经硅胶柱色谱，利用二氯甲烷/甲醇(体积比为100 ∶0、 30 ∶1、 20 ∶1、 10 ∶1、 8 ∶1、 5 ∶1、 3 ∶1、 1 ∶1和0 ∶100)进行梯度洗脱，得到9个馏分Fr.1～Fr.9。Fr.3重结晶得到化合物13(2.0 g)。Fr.2经硅胶柱色谱分离，利用石油醚/乙酸乙酯(体积比为100 ∶0、 20 ∶1、 10 ∶1、 5 ∶1、 3 ∶1、 1 ∶1和0 ∶100)进行梯度洗脱，收集馏分，经薄层层析(TLC)分析合并得到13个馏分(Fr.2.1～Fr.2.13)，其中Fr.2.9重结晶得到化合物15(4 mg)，Fr.2.6经制备HPLC(甲醇/水体积比20 ∶80)纯化得到化合物16(10.0 mg)，Fr.2.8经制备HPLC(甲醇/水体积比30 ∶70)纯化得到化合物24(14.2 mg)，Fr.2.11经制备HPLC(甲醇/水体积比30 ∶70)纯化得到化合物5(3.0 mg)、17(5.0 mg)、18(3.0 mg)和19(4.3 mg)。Fr.2.12经PRP树脂分离，利用水/乙醇(体积比1 ∶9、 1 ∶3、 1 ∶6、 1 ∶9和0 ∶1)进行梯度洗脱，收集馏分，经TLC分析合并得到6个馏分(Fr.2.12.1～Fr.2.12.6)。Fr.2.12.2经制备HPLC(甲醇/水体积比35 ∶65)纯化得到化合物1(10 mg)、2(10 mg)、14(20 mg)、22(2.7 mg)。Fr. 2.12.5经制备HPLC(甲醇/水体积比54 ∶46)纯化得到化合物3(10 mg)、4(11 mg)。Fr.2.12.3经制备HPLC(甲醇/水体积比47 ∶53)纯化得到化合物6(10 mg)、7(11 mg)。Fr.2.12.4经制备HPLC(甲醇/水体积比52 ∶48)纯化得到化合物8(3.7 mg)、9(5.3 mg)、10(13.8 mg)、11(6.3 mg)、12(3 mg)。Fr.2.12.1经制备HPLC(甲醇/水体积比25 ∶75)纯化得到化合物20(5 mg)、21(12 mg)。馏分Fr.2.13经制备HPLC(甲醇/水体积比25 ∶75)纯化得到化合物23(5.3 mg)。

1.3 分析测试方法

1.3.1HPLC分析 Diamonsil C18分析型反相色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)。流动相：甲醇(A)，超纯水(B)，0 min，10%A，25 min，90%A。PDA紫外检测器，流速为1 mL/min，进样量10 μL。

1.3.2HPLC制备 SilGreen C18色谱柱(250 mm×20 mm，5 μm)；流动相为甲醇/水，紫外波长210 nm，流速为8 mL/min。

1.3.3结构鉴定 质谱：电喷雾离子(ESI)源，毛细管电压为0.8 kV，离子源温度为600 ℃，荷质比扫描范围100～600。核磁共振：采用氘代二甲基亚砜或氘代氯仿作溶剂，13C NMR和1H NMR分别在400和100 MHz的条件下进行扫描。

1.4 抗肝癌活性实验

采用CCK-8法[8-9]，对化合物1～5和10～15进行了人肝癌细胞HepG2的细胞毒性测定，以5-Fu为阳性对照药。在96孔培养板上接种处于对数生长期的细胞，每孔180 μL，每孔1×104个细胞，实验组分别加入10 μL不同浓度的药物，对照组加入等体积DMSO溶液，空白组加入等体积的蒸馏水，每组设3个平行孔，在37 ℃下培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8，培养箱孵育2 h后，用酶标仪在450 nm波长下测定光密度(OD)值，计算细胞抑制率(I)，运用 SPSS 2020 统计软件计算半数抑制浓度(IC50)。

I=(OD对照组-OD实验组)/(OD对照组-OD空白组)×100%

2 结果与讨论

2.1 化合物分离结果

从油樟叶水提物中分离得到24个化合物，化合物1～24的结构见图1。这些化合物分别属于香豆素类化合物(1～2)、木脂素类化合物(3～10)、黄烷类化合物(11～12)、苯丙素类(19～20)、酚酸类(16～18、23～24)，其它类化合物(13～15、21～22)。除化合物1、3～4、7～8、13和17外，其它化合物均为首次从樟属植物中分离得到。

图1 化合物1～24的结构Fig.1 The structures of compounds 1-24

2.2 化合物的结构表征

化合物1：无色针状结晶(甲醇)，分子式C10H8O4，m.p. 201～203 ℃。ESI-MS(m/z): 191[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 10.33(1H, br s, 7-OH), 7.90(1H, d,J=9.2 Hz, H- 4), 7.21(1H, s, H-5), 6.77(1H, s, H-8), 6.21(1H, d,J=9.6 Hz, H-3), 3.81(3H, s, 6-OCH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 160.7(C-2), 151.2(C-7), 149.5(C-9), 145.3(C- 4), 144.5(C- 6), 111.7(C-10), 110.6(C-5), 109.6(C-3), 102.8(C-8), 56.0(6-OCH3)。以上数据与文献[10]基本一致，故鉴定为6-甲氧基-7-羟基香豆素。

化合物2:黄色粉末(甲醇)，分子式C11H10O5，m.p. 149～152 ℃。ESI-MS(m/z): 223[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.89(1H, d,J=9.6 Hz, H- 4), 7.00(1H, s, H-5), 6.20(1H, d,J=9.2 Hz, H-3), 3.81(6H, s, 6, 8-OCH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 160.3(C-2), 145.7(C- 6), 145.0(C- 4, 9), 143.1(C-7), 134.7(C-8), 111.9(C-3), 110.1(C-10), 104.5(C-5), 60.7(6-OCH3), 56.2(8-OCH3)。以上数据与文献[11]基本一致，因此鉴定该化合物为异嗪皮啶。

化合物3：白色粉末(氯仿)，化学式C22H26O6，m.p. 123～125 ℃。ESI-MS(m/z): 387[M+H]+。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 6.76(2H, t,J=8.0 Hz, H-2, 5), 6.68(1H, d,J=2.0 Hz, H-2’), 6.65(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H-5’), 6.55(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6), 6.48(1H, d,J=2.0 Hz, H- 6’), 4.12(1H, dd,J=9.2, 7.2 Hz, H-9’a), 3.88(1H, m, H-9’b), 3.86(3H, s, 3-OCH3), 3.85(3H, s, 3’-OCH3), 3.83(3H, s, 4-OCH3), 3.82(3H, s, 4’-OCH3), 2.94(2H, m, H-7a, 7b), 2.60(2H, m, H-7’a, 8’), 2.51(2H, m, H-7’b, 8)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 178.9(C-9), 149.2(C-3), 149.1(C-3’), 148.1(C- 4), 148.0(C- 4’), 130.5(C-1), 130.3(C-1’), 121.5(C- 6), 120.7(C- 6’), 112.4(C-2’), 111.9(C-2’), 111.4(C-5’), 111.2(C-5), 71.4(C-9’), 56.0(3, 3’, 4, 4’-OCH3), 46.7(C-8), 41.2(C-8’), 38.3(C-7), 34.6(C-7’)。以上数据与文献[12]基本一致，因此鉴定该化合物为甲基牛蒡酚。

化合物4：淡黄油状物(氯仿)，化学式C20H18O7，b.p. 467～567 ℃。ESI-MS(m/z): 369[M-H]-。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 7.57(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6’), 7.46(1H, d,J=1.6 Hz, H-2’), 6.96(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 6.87(1H, d,J=8.0 Hz, H-5), 6.85(1H, m, H- 6), 6.77(1H, d,J=8.0 Hz, H-5’), 6.06(2H, s, —OCH2O—), 5.95(2H, s, —OCH2O—), 4.65(1H, d,J=8.8 Hz, H-7), 4.28(1H, m, H-9’a), 4.13(1H, m, H-9’b), 4.10(1H, m, H-8’), 3.75(1H, dd,J=10.8, 4.4 Hz, H-9a), 3.65(1H, dd,J=10.8, 1.6 Hz, H-9b), 2.85(1H, m, H-8)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 197.5(C-7’), 152.3(C- 4’), 148.5(C-3), 148.1(C-3’), 147.6(C- 4), 134.5(C-1), 131.5(C-1’), 125.0(C- 6), 120.5(C- 6’), 108.4(C-2’), 108.2(C-2’), 108.2(C-5’), 107.2(C-5), 102.1(—OCH2O—), 101.2(—OCH2O—), 83.8(C-7), 70.9(C-9), 61.4(C-9’), 52.4(C-8), 50.0(C-8’)。以上数据与文献[13]基本一致，因此鉴定该化合物为(+)-表芝麻酮。

化合物5：无色块状晶体(甲醇)，化学式C20H20O6，m.p. 164～165 ℃。ESI-MS(m/z): 357[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.94(1H, d,J=1.6 Hz, H-2), 6.89(1H, d,J=8.0 Hz, H-2’), 6.87(1H, d,J=1.6 Hz, H-5), 6.82(1H, dd,J=8.0, 1.6 Hz, H-5’), 6.78(2H, m, H- 6, 6’), 5.95(2H, m, —OCH2O—), 5.60(1H, s, 4’-OH), 4.85(1H, d,J=5.2 Hz, H-7’), 4.42(1H, d,J=7.2 Hz, H-7), 4.11(1H, d,J=9.2 Hz, H-9’a), 3.91(3H, s, 3’-OCH3), 3.84(2H, m, H-9b, 9’b), 3.31(2H, m, H-9a, 8’), 2.87(1H, m, H-8)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 148.1(C-3’), 147.3(C- 4), 146.5(C-3), 144.7(C- 4’), 135.2(C-1), 130.4(C-1’), 119.7(C- 6), 118.5(C- 6’), 114.4(C-2), 108.4(C-5), 108.3(C-5’), 106.7(C-2’), 101.2(—OCH2O—), 87.8(C-7), 82.2(C-7’), 71.1(C-9’), 69.9(C-9), 56.1(3’-OCH3), 54.7(C-8), 50.2(C-8’)。以上数据与文献[14]基本一致，因此鉴定该化合物为(7R,7’S,8R,8’R)-3,4-亚甲二氧基-3’-甲氧基- 4’-羟基-7,9’：7’,9-双环氧木脂烷。

化合物6：白色粉末(甲醇)，化学式C20H22O6，m.p. 138～139 ℃。ESI-MS(m/z): 359[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ： 8.93(1H, s, 4-OH), 8.89(1H, s, 4’-OH), 6.90(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 6.88(1H, s, H-2’), 6.76(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6), 6.73(2H, d,J=1.2 Hz, H-5’, 6’), 6.72(1H, d,J=8.4 Hz, H-5), 4.75(1H, d,J=6.0 Hz, H-7), 4.29(1H, d,J=6.8 Hz, H-7’), 4.04(1H, dd,J=9.2, 1.2 Hz, H-9’a), 3.76(6H, s, 3,3’-OCH3), 3.73(1H, d,J=6.0 Hz, H-9b), 3.71(1H, d,J=8.4 Hz, H-9’b), 3.17(2H, d,J=4.8 Hz, H-9a, 8’), 3.07(1H, t,J=8.4 Hz, H-8’)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.5(C-3), 147.3(C-3’), 146.0(C- 4), 145.3(C- 4’), 132.4(C-1), 129.6(C-1’), 118.7(C- 6), 117.9(C- 6’), 115.2(C-5, 5’), 110.3(C-2), 109.7(C-2’), 87.0(C-7), 81.4(C-7’), 70.3(C-9), 68.9(C-9’), 55.6(3, 3’-OCH3), 54.0(C-8), 49.4(C-8’)。以上数据与文献[15]基本一致,因此鉴定该化合物为(+)-表松脂醇。

化合物7：无色油状物(甲醇)，化学式C20H22O6，b.p. 506～606 ℃。ESI-MS(m/z): 359[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.94(2H, s, 4, 4’-OH), 6.89(2H, d,J=1.6 Hz, H-2, 2’), 6.75(2H, dd,J=8.0, 1.6 Hz, H- 6, 6’), 6.73(2H, d,J=8.0 Hz, H-5, 5’), 4.60(2H, d,J=1.6 Hz, H-7, 7’), 4.11(2H, m, H-9), 3.76(6H, s, 3, 3’-OCH3), 3.72(2H, dd,J=9.2, 3.6 Hz, H-9’), 3.03(2H, m, H-8, 8’)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.6(C-3, 3’), 146(C- 4, 4’), 132.3(C-1, 1’), 118.7(C- 6, 6’), 115.2(C-2, 2’), 110.4(C-5, 5’), 85.2(C-7, 7’), 70.9(C-9, 9’), 55.6(3, 3’-OCH3), 53.6(C-8, 8’)。以上数据与文献[16]基本一致，因此鉴定该化合物为(+)-松脂醇。

化合物8：黄色油状物(甲醇)，化学式C21H24O6，b.p. 670～790 ℃。ESI-MS(m/z): 371[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.96(1H, br s, 4-OH), 6.92(1H, m, H-2), 6.89(2H, s, H-2’, 5), 6.88(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6), 6.75(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6’), 6.72(1H, d,J=8.0 Hz, H-5’), 4.65(1H, d,J=4.0 Hz, H-7), 4.61(1H, d,J=4.0 Hz, H-7’), 4.12(2H, dd,J=9.2, 2.0 Hz, H-9), 3.76(3H, s, 4-OCH3), 3.75(3H, s, 3’-OCH3), 3.73(3H, s, 3-OCH3), 3.04(2H, p,J=3.9 Hz, H-9’)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 148.8(C-3’), 148.2(C- 4’), 147.6(C-3), 146.0(C- 4), 133.9(C-1’), 132.2(C-1), 118.7(C- 6), 118.2(C- 6’), 115.2(C-5), 111.6(C-5’), 110.4(C-2), 109.9(C-2’), 85.2(C-7), 85.0(C-7’), 71.1(C-9), 71.0(C-9’), 55.6(3-OCH3), 55.6(4-OCH3), 55.5(3’-OCH3), 53.8(C-8), 53.6(C-8’)。以上数据与文献[17]基本一致，因此鉴定该化合物为(+)-松脂素单甲基醚。

化合物9：黄色油状物(甲醇)，化学式C22H26O7，b.p. 514～614 ℃。ESI-MS(m/z): 401[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.98(1H, br s, 4-OH), 6.89(1H, dd,J=5.2, 1.6 Hz, H-2), 6.75(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H- 6), 6.72(1H, d,J=8.0 Hz, H-5), 6.64(2H, s, H-2’, 6’), 4.66(1H, d,J=4.4 Hz, H-7), 4.62(1H, d,J=4.4 Hz, H-7’), 4.15(2H, m, H-9a, 9b), 3.77(6H, s, 3,3’-OCH3), 3.76(3H, s, 5-OCH3), 3.75(3H, s, 4-OCH3), 3.63(2H, s, H-9’a, 9’b), 3.04(2H, td,J=4.6, 2.0 Hz, H-8, 8’)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 152.9(C-3, 5), 147.6(C-3’), 146.0(C- 4’), 137.3(C- 4), 136.6(C-1), 132.2(C-1’), 118.7(C- 6’), 115.2(C-5’), 110.4(C-2’), 103.1(C-2, 6), 85.2(C-7, 7’), 71.3(C-9), 71.0(C-9’), 60.0(4-OCH3), 55.9(3,5-OCH3), 55.6(3’-OCH3), 53.9(C-8), 53.5(C-8’)。以上数据与文献[18]基本一致，因此鉴定该化合物为(+)-O-去甲基木兰木脂素。

化合物10：白色结晶性粉末(甲醇)，化学式C21H24O6，m.p. 133 ℃。ESI-MS(m/z): 371[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.91(1H, s, 4-OH), 6.93(1H, d,J=1.6 Hz, H-2’), 6.89(3H, m, H-2, 5’, 6’), 6.74(2H, d,J=2.0 Hz, H-5, 6), 4.75(1H, d,J=5.6 Hz, H-7’), 4.35(1H, d,J=7.2 Hz, H-7), 4.06(1H, dd,J=9.2, 1.2 Hz, H-9b), 3.76(3H, s, 3’-OCH3), 3.74(3H, s, 4’-OCH3), 3.73(3H, s, 3-OCH3), 3.71(1H, d,J=2.0 Hz, H-9’ b), 3.33(2H, m, H-9a, 8’), 3.09(1H, t,J=8.4 Hz, H-9’a), 2.82(1H, m, H-8)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 148.8(C-3’), 148.3(C-3), 147.3(C- 4’), 145.3(C- 4), 134.0(C-1), 129.6(C-1’), 118.3(C- 6), 117.9(C- 6’), 115.2(C-5), 111.6(C-5’), 109.7(C-2, 2’), 86.8(C-7), 81.4(C-7’), 70.3(C-9), 69.0(C-9’), 55.6(3, 3’, 4’-OCH3), 54.1(C-8), 49.4(C-8’)。以上数据与文献[19]基本一致，因此鉴定该化合物为连翘脂素。

化合物11:无色簇状晶体(甲醇)，化学式C18H20O6，m.p. 148～150 ℃。ESI-MS(m/z): 331[M-H]-。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 6.96(3H, s, H-2’, 5’, 6’), 6.12(2H, d,J=10.0 Hz, H- 6, 8), 4.64(1H, dd,J=8.4, 2.4 Hz, 3-OH), 4.07(1H, d,J=4.0 Hz, H-3), 3.91(3H, s, 7-OCH3), 3.81(3H, s, 3’-OCH3), 3.75(3H, s, 5-OCH3), 3.08(1H, dd,J=16.4, 2.4 Hz, H- 4a), 2.59(1H, dd,J=16.4, 9.2 Hz, H- 4b)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 159.8(C-7), 158.9(C-5), 155.4(C-9), 147.0(C- 4’), 146.2(C-3’), 129.7(C-1’), 120.8(C- 6’), 114.7(C-5’), 109.6(C-2’), 101.8(C-10), 93.1(C-8), 92.0(C- 6), 82.0(C-2), 68.5(C-3), 56.1(4’-OCH3), 55.7(7-OCH3), 55.5(5-OCH3), 27.8(C- 4)。以上数据与文献[20]基本一致，因此鉴定该化合物为(2R, 3S)- 4’-羟基-5, 7, 3’-三甲氧基黄烷-3-醇。

化合物12:白色粉末(甲醇)，化学式C18H20O6，m.p. 106～107 ℃。ESI-MS(m/z): 331[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.90(1H, s, 4-OH), 7.05(1H, d,J=2.0 Hz, H-2’), 6.85(1H, dd,J=8.4, 2.0 Hz, H- 6’), 6.73(1H, d,J=8.0 Hz, H-5’), 6.12(1H, d,J=2.0 Hz, H- 6), 6.06(1H, d,J=2.4 Hz, H-8), 4.76(1H, d,J=4.4 Hz, 3-OH), 4.07(1H, d,J=4.0 Hz, H-3), 3.75(3H, s, 7-OCH3), 3.74(3H, s, 3’-OCH3), 3.70(3H, s, 5-OCH3), 2.75(1H, dd,J=16.8, 4.4 Hz, H- 4a), 2.57(1H, dd,J=16.8, 4.4 Hz, H- 4b)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 158.9(C-7), 158.7(C-5), 155.6(C-9), 147.0(C- 4’), 145.9(C-3’), 130.4(C-1’), 119.6(C- 6’), 114.8(C-5’), 111.5(C-2’), 101.0(C-10), 93.3(C-8), 91.2(C- 6), 78.3(C-2), 64.5(C-3), 55.6(3’-OCH3), 55.4(7-OCH3), 55.1(5-OCH3), 28.5(C- 4)。以上数据与文献[21]基本一致，因此鉴定该化合物为(2S, 3S)- 4’-羟基-5, 7, 3’-三甲氧基黄烷-3-醇。

化合物13：黄色粉末(甲醇)，化学式C15H10O7，m.p. 314 ℃。ESI-MS(m/z): 303[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 12.50(1H, s, 5-OH), 10.81(1H, s, 7-OH), 9.39(1H, s, 2-OH), 9.62(1H, br s, 3’-OH), 9.33(1H, s, 4’-OH), 6.41(1H, d,J=2.0 Hz, H-8), 6.18(1H, d,J=2.0 Hz, H- 6), 7.67(1H, d,J=2.2 Hz, H-2’), 7.54(1H, dd,J=2.2, 8.4 Hz, H - 6′), 6.88(1H, d,J=8.5 Hz, H-5’)。与槲皮素标准品进行TLC对照，Rf值及显色行为均一致。以上数据与文献[22]基本一致，因此鉴定该化合物为槲皮素。

化合物14：无色片状晶体(甲醇)，化学式C11H16O3，m.p. 151～153 ℃。ESI-MS(m/z): 195[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 5.78(1H, s, H-7), 5.01(1H, s, 3-OH), 4.08(1H, t,J=4.0 Hz, H-3), 2.29(1H, dt,J=13.2, 2.4 Hz, H- 4a), 1.86(1H, m, H-2a), 1.66(3H, s, —CH3), 1.62(1H, dd,J=13.2, 4.0 Hz, H- 4b), 1.41(1H, dd,J=14.0, 3.6 Hz, H-2b), 1.37(3H, s, —CH3), 1.19(3H, s, —CH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 183.1(C- 6), 171.1(C-8), 112.1(C-7), 86.6(C-5), 64.9(C-3), 46.7(C- 4), 45.3(C-2), 35.7(C-1), 30.5(C-9), 26.9(C-11), 26.2(C-10)。以上数据与文献[23]基本一致，故鉴定为黑麦草内酯。

化合物15：黄色油状物(氯仿)，化学式C8H8O4，b.p. 269～353 ℃。ESI-MS(m/z): 169[M+H]+。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 5.85(2H, s, H-3, 5), 3.82(6H, s, 2, 6-OCH3)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 187.0(C- 4), 176.8(C-1), 157.4(C-2, 6), 107.6(C-3, 5), 56.6(2, 6-OCH3)。以上数据与文献[24]基本一致，因此鉴定该化合物为2, 6-二甲氧基对苯醌。

化合物16:褐色粉末(甲醇)，化学式C6H6O2，m.p. 103 ℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 6.71(2H, dd,J=5.9, 3.6 Hz, H-2, 6), 6.59(2H, dd,J=5.9, 3.6 Hz, H-1, 5)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 145.3(C-3, 4), 119.3(C-2, 6), 115.7(C-1, 5)。以上数据与文献[25]基本一致，因此鉴定该化合物为邻苯二酚。

化合物17：白色针状晶体(甲醇)，化学式C8H8O4，m.p. 208～210 ℃。ESI-MS(m/z): 167[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.42(2H, H-2, 6), 6.83(1H, d,J=8.7 Hz, H-5), 3.79(3H, s, 3-OCH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 167.5(1-COOH), 151.1(C-3), 147.3(C- 4), 123.6(C-1), 122.0(C- 6), 115.1(C-5), 112.8(C-2), 55.6(3-OCH3)。以上数据与文献[26]基本一致，因此鉴定该化合物为香草酸。

化合物18：白色粉末(氯仿)，化学式C9H12O3，m.p. 40～42 ℃。ESI-MS(m/z): 169[M+H]+。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ: 6.87(1H, m, H-2), 6.73(2H, dd,J=6.8, 2.0 Hz, H-5, 6), 3.89(3H, s, 3-OCH3), 3.83(2H, t,J=6.4 Hz, H-7), 2.80(2H, t,J=6.4 Hz, H-8)。13C NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 146.7(C- 4), 144.4(C-3), 130.4(C-1), 121.8(C- 6), 114.6(C-2), 111.6(C-5), 64.0(C-8), 56.0(3-OCH3), 39.0(C-7)。以上数据与文献[27]基本一致，因此鉴定该化合物为3-甲氧基- 4-羟基苯乙醇。

化合物19：白色粉末(甲醇)，化学式C10H14O3，m.p. 63～65 ℃。ESI-MS(m/z): 181[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：8.69(1H, s, 4-OH), 6.72(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 6.65(1H, d,J=8.0 Hz, H-5), 6.55(1H, dd,J=8.0, 2.0 Hz, H-6), 4.45(1H, s, 9-OH), 3.73(3H, s, 3-OCH3), 3.39(2H, d,J=8.0 Hz, H-9a, 9b), 2.47(2H, d,J=8.0 Hz, H-7a, 7b), 1.66(2H, m, H-8a, 8b)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.4(C- 4), 144.4(C-3), 133.0(C-1), 120.3(C- 6), 115.3(C-2), 112.5(C-5), 60.2(C-9), 55.5(3-OCH3), 34.7(C-8), 31.3(C-7)。以上数据与文献[28]基本一致，因此鉴定该化合物为二氢松柏醇。

化合物20：褐色粉末(甲醇)，化学式C11H16O4，m.p. 75.5～76.5 ℃。ESI-MS(m/z): 211[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 8.03(1H, s, 4-OH), 6.42(2H, s, H-2, 6), 4.45(1H, t,J=5.2 Hz, 9-OH), 3.72(6H, s, 3, 5-OCH3), 3.40(2H, td,J=6.6, 5.2 Hz, H-9a, 9b), 2.47(2H, d, H-7a, 7b), 1.68(2H, m, H-8a, 8b)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 147.9(C-3, 5), 133.4(C- 4), 132.2(C-1), 105.6(C-2, 6), 60.2(C-9), 55.9(3, 5-OCH3), 34.6(C-8), 31.8(C-7)。以上数据与文献[29]基本一致，因此鉴定该化合物为3, 5-二甲氧基- 4-羟基苯丙醇。

化合物21：黄色油状物(甲醇)，化学式C11H14O5，b.p. 381～471 ℃。ESI-MS(m/z): 227[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.28(2H, s, H-2, 6), 5.09(1H, q,J=6.8 Hz, H-8), 4.71(1H, t,J=5.6 Hz, 4-OH), 3.82(6H, s, 3, 5-OCH3), 1.27(3H, d,J=6.4 Hz, CH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 200.0(C-7), 147.6(C-3, 5), 141.1(C- 4), 124.8(C-1), 106.6(C-2, 6), 68.1(C-8), 56.2(3, 5-OCH3), 21.3(CH3)。以上数据与文献[30]基本一致，因此鉴定该化合物为2-羟基-1-(4-羟基-3, 5-二甲氧基苯基) -1-丙酮。

化合物22：白色粉末(甲醇)，化学式C10H12O5，m.p. 103～107 ℃。ESI-MS(m/z): 211[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.14(2H, s, H-2, 6), 3.81(9H, s, 3, 5, 7-OCH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 166.2(C-7), 147.6(C-3, 5), 140.6(C- 4), 119.2(C-1), 106.7(C-2, 6), 56.0(3,5-OCH3), 51.9(7-OCH3)。以上数据与文献[31]基本一致，因此鉴定该化合物为丁香酸甲酯。

化合物23：黄色油状物(甲醇)，化学式C10H14O2，b.p. 428 ℃。ESI-MS(m/z): 165[M-H]-。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.20(1H, t,J=7.6 Hz, H-2), 7.16(1H, s, H-3), 7.12(1H, dt,J=7.6, 1.6 Hz, H-5), 7.06(1H, dt,J=7.6, 1.6 Hz, H- 6), 5.19(1H, d,J=4.0 Hz, 1’-OH), 4.17(1H, t,J=5.6 Hz, H-1’), 4.49(1H, m, 2’-OH), 3.41(2H, d,J=5.2 Hz, H-2’a, H-2’b), 2.58(2H, q,J=7.6 Hz, CH2), 1.17(3H, t,J=7.6 Hz, CH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 143.5(C-1), 143.2(C- 4), 127.8(C- 6), 126.3(C-5), 125.8(C-2), 123.7(C-3), 74.0(C-1’), 67.6(C-2’), 28.3(CH2), 15.7(CH3)。以上数据与文献[32]基本一致，因此鉴定该化合物为1-(4-乙基苯基)-1,2-乙二醇。

化合物24：白色针状晶体(甲醇)，化学式C8H8O2，m.p. 132～135 ℃。ESI-MS(m/z): 137[M+H]+。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.81(1H, d,J=2.0 Hz, H-2), 7.81(1H, d,J=2.0 Hz, H- 6), 6.83(1H, d,J=2.0 Hz, H-3), 6.81(1H, d,J=2.0 Hz, H-5), 2.44(3H, s, CH3)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 129.1(C-1), 131.5(C-2, 6), 115.9(C-3, 5), 162.7(C- 4), 197.7(C-7), 26.8(C-8)。以上数据与文献[33]基本一致，因此鉴定该化合物为对羟基苯乙酮。

2.3 化合物抗肝癌活性结果

对化合物1～5和10～15进行人肝癌细胞HepG2的细胞毒性测定，结果显示：化合物2、5和13对人肝癌细胞HepG2具有中等抑制活性，半数抑制浓度(IC50)分别为33.43、 107.40和71.43 μmol/L，阳性对照药5-Fu的IC50为11.76 μmol/L，其它化合物IC50≥200 μmol/L。与已有的文献对比发现，本研究首次报道化合物5具有较好的抗肝癌活性；化合物2为香豆素类化合物，研究显示该类化合物具有广泛的抗肿瘤活性, 且结构简单易修饰, 是良好的先导化合物；报道显示化合物13作用HepG2细胞24 h的IC50为110.50 μmol/L[34]，与本研究数据接近，化合物13为黄酮类化合物，文献显示该类化合物对多种常见的癌症如肺癌、肝癌、胃癌等均具有显著的防治效果，在抗肿瘤药物研究方面表现出较好应用前景。

3 结 论

3.1通过系统深入的化学成分研究，分离、纯化和鉴定油樟叶水提物化合物24个，包括香豆素类2个(1～2)，木脂素类8个(3～10)，黄烷类2个(11～12)，酚酸类5个(16～18、23～24)，苯丙素类2个(19～20)及其它类5个(13～15、21～22)。除化合物1、3～4、7～8、13和17外，其它化合物均为首次从樟属植物中分离得到。

3.2化合物2、5和13对人肝癌细胞HepG2具有中等抑制活性，半数抑制浓度(IC50)分别为33.43、 107.40和71.43 μmol/L，化合物5的抗肝癌活性为首次报道。