牡蛎捕后贮运过程中的活力和呈味特性

闫丽新，殷中专，蔡琰，刘俊荣，徐昙烨，田元勇

（大连海洋大学食品科学与工程学院 辽宁大连 116023）

牡蛎是我国海水养殖产量最多的贝类，2020年产量为542.46 万t[1]，牡蛎活品具有较高的营养和经济价值。自然环境中牡蛎生长在潮间带，能够承受频繁的低氧/复氧应激，并使线粒体在整个低氧/复氧循环中保持较好的功能[2]。牡蛎相较于虾夷扇贝和菲律宾蛤仔具有更强的耐干露能力。徐美禄等[3]研究发现牡蛎可在6 d 内保持良好品质。而菲律宾蛤仔和虾夷扇贝的耐干露极限分别为4 d 和2 d[4]。目前，牡蛎活品捕后以无水运输为主，到达市场后进行干藏或湿藏方式销售。湿藏销售因存在成本高、营养消耗等弊端，故干藏销售模式应用更为广泛。“无水运输-干藏销售”模式下长时期干露对牡蛎活品货架期产生不利影响。贝类捕后早期因环境变化剧烈，活力和风味下降最明显，是品质易逝期[5]。牡蛎在无水运输过程中高密度、物理碰撞和挤压等胁迫导致其体内乳酸、章鱼碱等无氧代谢物质的积累[6]。在干露运输后增加复水处置，可以提高牡蛎活品贮藏稳定性[3]。本研究根据牡蛎现有流通状况，利用无水运输，在到达销售地后增加复水操作来消除缺氧胁迫影响，使其品质恢复，进而延长活品货架期。考虑到内陆地区消费需求，采用人工海水代替天然海水对牡蛎进行复水操作。模拟“无水运输-人工海水复水-干藏销售”的捕后流通模式，对模拟流通过程品质变化进行评价。

影响活品牡蛎品质因素包括活力、呈味特性、微生物等指标。活力通常采用三磷酸腺苷（Adenosine triophosphate，ATP）关联化合物进行评价。鲜味是牡蛎的重要呈味特性，影响其鲜味的物质包括氨基酸、有机酸、核苷酸和碱类，此外，一些小分子肽确定为鲜味的贡献者。呈鲜味的氨基酸主要是以谷氨酸为代表，有鲜味的天然氨基酸，如天冬氨酸，在贝类中以游离态和结合态两种形式存在。鲜味代表性的核苷酸主要是5＇-鸟苷酸（5＇-GMP）、5＇-肌苷酸（5＇-IMP）和5＇-腺苷酸（5＇-AMP），在扇贝中主要是AMP 和IMP。贝类特征滋味形成的主要物质还有琥珀酸及其钠盐。此外，牡蛎是滤食性贝类，当这些软体动物来自受污染地区时，会将致病菌带给消费者，增加了食源性疾病的风险[7-8]。近年来，高通量测序技术在分析微生物菌落组成方面已很成熟，利用其分析牡蛎体内的菌落组成情况，可为牡蛎的食用安全提供基础信息。

本研究模拟牡蛎捕后流通过程，将采捕后的牡蛎立即装入泡沫箱内并用冰袋冷却，无水运输1 d，然后，将人工海水复水（36 h）后的牡蛎干藏（10 d），通过活力、呈味物质含量、微生物3 个指标评价模拟流通过程中的品质变化。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

太平洋牡蛎（120 个）于2020 年9 月2 日购于大连石城岛生蚝小镇，质量（187.08±18.48）g。

氯化钠（分析纯）、磷酸氢二钠（分析纯）、碘乙酸钠（分析纯）、氢氧化钾（色谱纯），中国天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯），美国Sigma 公司；高氯酸、硫酸、盐酸、磷酸、磷酸氢二钾（色谱纯）、磷酸二氢钾（色谱纯）、氯化钾（分析纯）、蒽酮（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯），天津市富宇精细化工有限公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2、3、5-Triphenytetrazoliumchloride，TTC）（分析纯），中国北京索莱宝科技有限公司；琥珀酸钠（分析纯），大连美仑生物技术有限公司。平板计数琼脂、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（Lauryl Sulfate Tryptose Broth，LST）、煌绿乳酸胆盐肉汤（Brilliant Green Lactose Bile Broth，BGLB），北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 高效液相色谱仪，美国Agilent公司；UV-1800PC 紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；BS224S 型精密电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；PB-10 pH 计，德国Sartorius 公司；Milli-Q 超纯水净化仪，美国Millipore 公司；L-8900 全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；GL-21M 高速冷冻离心机，德国HERMLE Labortechnik GmbH 公司；无菌实验台，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.3 试验方法

1.3.1 原料与处理 太平洋牡蛎采捕后立即装入泡沫箱（加冰袋降温），无水运输至实验室（约5 h）。到达实验室后继续在泡沫箱里放置1 d，模拟无水运输。然后，放入循环水槽进行复水处置36 h（人工海水，盐度2.8%，氧质量浓度5.51 mg/L，温度25.1 ℃，循环速率3 次/h，贝水比1∶10）。将牡蛎放在4 ℃冰柜干露贮藏10 d，模拟销售。贮藏过程中使用人工海水浸湿的湿布进行保湿处置。模拟过程取样点见表1。分离牡蛎闭壳肌于-80 ℃条件下贮藏，用于ATP 等理化指标的检测。软体部分用灭菌匀浆器混匀，用于细菌总数的检测和微生物高通量测序。

表1 模拟流通过程牡蛎取样点Table 1 Sampling points of oyster during simulated supply chain

1.3.2 模拟流通过程的牡蛎活力分析 在活力分析前测定样品的质量。选取5 只牡蛎，准确称其质量，监测模拟流通过程中质量的变化。活力评价指标包括闭壳肌糖原含量、pH 值、ATP 相关化合物含量、核苷酸能荷以及鳃中琥珀酸脱氢酶活力。

1）闭壳肌中糖原含量的测定 取2.0 g 闭壳肌，加入30% KOH 溶液4 mL，沸水浴消化20 min。冷却至室温后加入无水乙醇20 mL，3 000 g离心15 min，取沉淀。沉淀中依次加入10 mL 水、15 mL 无水乙醇和1 滴饱和氯化钾溶解，3 000 g离心15 min，取沉淀加水溶解后用蒽酮比色法测定其含量[9]。

2）闭壳肌中pH 值的测定 取2.0 g 闭壳肌，立刻加入10 mL 20 mmol/L 碘乙酸钠溶液，冰浴条件下用玻璃棒将肌肉充分捣碎，静置25 min，用精密pH 计测定。

3）闭壳肌中ATP 及其关联化合物的提取及测定 分别称取1.0 g 闭壳肌，加入10 mL 5%PCA 溶液，冰浴条件下捣碎10 min 后用2 mol/L KOH 调pH 值在2～3.5 之间，然后定容20 mL，5 000×g 离心5 min，将上清液用0.45 μm 滤膜过滤，取4.0 mL 加入1 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液，待分析。用高效液相色谱法分析，选取日本GL sciences 公司（ODS-SP C18，4.6 mm×250 mm，5 μm）的色谱柱；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；温度：30 ℃；流速：0.8 mL/min；流动相：0.1 mol/L 磷酸盐缓冲溶液，并用磷酸调pH 值至6.5[10]。核苷酸能荷（AEC）计算公式：

式中：ATP——三磷酸腺苷含量；ADP——二磷酸腺苷含量；AMP——磷酸腺苷含量[11]。

4）鳃中琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase,SDH）活力的测定 称取牡蛎鳃1.0 g，剁碎后加入10 mL TTC 溶液（0.2%TTC、0.1%琥珀酸钠、3%氯化钠、2.84%磷酸氢二钠），37 ℃水浴30 min 后放入冰中立即冷却，加入15 mL 无水乙醇搅拌30 min，3 000×g 离心5 min，取上清液用0.45 μm 滤膜过滤，在485 nm 处测定其吸光度，根据三苯基甲臜（Triphenylformazan，TF）标准曲线计算TF 的生成量。以单位时间内TF 的生成量定义为1个酶活力单位U[12]。

1.3.3 模拟流通过程太平洋牡蛎呈味特性分析将牡蛎（5 只）全部软体匀浆，称取0.5 g，加入0.02 mol/L HCl 10 mL，10 000 r/min 均质30 s，定容100 mL，10 000×g 离心10 min，用0.45 μm 滤膜将上清液过滤，用全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量。称取牡蛎软体匀浆组织1.0 g，参考闭壳肌中ATP 及其关联化合物的提取及测定方法测定全软体AMP、IMP 含量。最后折合成每mL 提取液中的呈味化合物含量，计算味觉活度值（taste activity value,TAV），对各种呈味物质的影响进行评价。TAV 值为太平洋牡蛎全软体呈味化合物含量与其阈值之间的比值[13]。

1.3.4 模拟流通过程牡蛎微生物指标分析

1）细菌总数的测定 将试验用牡蛎刀、生理盐水在121 ℃条件下杀菌15 min，冷却至室温，备用。用灭菌的牡蛎刀剖开牡蛎外壳，取软体组织25.0 g，加无菌生理盐水225 mL，匀浆，取匀浆液测定细菌总数。测定方法采用GB/T 4789.2-2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》[14]。

2）高通量测序 采用SDS 方法提取样本的基因组DNA。以稀释的基因组DNA 为模板，根据测序区域的选择，采用16S DNA 的V4区特异引物515 F 和806 R 进行PCR 扩增。PCR 产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。将构建好的文库经Qubit 和Q-PCR 定量，文库合格后使用NovaSeq6000 上机测序。根据Barcode 序列和PCR 扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去Barcode 和引物序列后对每个样本的reads 进行拼接，过滤处理得到高质量的Tags 数据。通过与物种注释数据库进行比对检测嵌合体序列，最终去除其中的嵌合体序列，得到有效数据。利用Uparse[15]软件对所有样本的有效数据进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units）。根据所有样本在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35 的属，根据其在每个样本中的丰度信息，从物种和样本两个层面进行聚类，采用Fasttree 软件+R 语言制作热图（由北京诺禾致源生物信息科技有限公司协助完成）。

1.4 统计分析

2 结果与分析

2.1 牡蛎模拟流通过程中活力变化

牡蛎质量与其销售价格密切相关。太平洋牡蛎初始质量为187.08 g，经1 d 的无水运输，质量下降为183.39 g。复水后其质量恢复至192.19 g。后期干藏过程中因能量物质的消耗其质量呈下降趋势，第10 天质量降至最低，174.25 g。

牡蛎模拟流通过程活力指标如图1 所示。牡蛎初始糖原含量为7.92 mg/g，无水运输1 d 后降至5.84 mg/g。复水后糖原含量没有明显变化，在后期干藏过程中逐渐下降。糖原是牡蛎重要的能源物质，运输过程中无氧代谢被大量消耗。牡蛎是附着性贝类，肌肉不需要储备较多糖原，而像虾夷扇贝等具有较强活动能力的贝类，需要通过横纹肌快速收缩，游泳以躲避海星等捕食者等行为，扇贝闭壳肌糖原储备可达50 mg/g[16]。复水期间，由于人工海水中缺乏牡蛎可以利用的食物，因此缺氧胁迫虽解除，但牡蛎糖原含量并没有明显恢复。此外，有研究表明，核苷酸和磷酸精氨酸的恢复速度比糖原恢复速度快[17]，因此，糖原含量复水后没有明显恢复。后期干藏过程中糖原含量呈下降趋势的主要原因是缺氧胁迫，牡蛎消耗体内的糖原来维持自身的生理代谢。

图1 模拟流通过程中牡蛎闭壳肌能量变化Fig.1 Energy changes of adductor muscle of oyster during simulated supply chain

牡蛎模拟流通过程中ATP 相关化合物含量变化如图1b 所示。牡蛎无水运输1 d 后，ATP 含量由2.29 μmol/g 降至1.42 μmol/g，人工海水复水后恢复至1.94 μmol/g。后期干藏过程中ATP 含量逐渐降低，相应的AMP 含量呈上升趋势。ATP 是一种高能磷酸化合物，可为细胞各项生命活动提供能量[18-19]。运输过程中牡蛎进行无氧糖酵解，通过消耗体内的糖原产生ATP 来维持自身的生理代谢，使ATP 含量没有明显变化。后期干藏过程中，糖原含量的减少使其不能满足自身正常代谢需求，开始消耗体内的ATP 来维持平衡，因此ATP 含量逐渐降低。本试验中牡蛎均为活品，未检测到仅在贝类死后才产生的HxR 和Hx。ATP 存在ATP→ADP→AMP→IMP/AdR→HxR→Hx 两种降解途径，有研究表明，牡蛎肌肉中这两种降解途径共同存在，然而，由于AdR 脱氨酶活性较高，导致降解速率较快，因此在此过程中并没有检测到[20]。

牡蛎模拟流通过程中AEC 值变化如图1c 所示。牡蛎无水运输、复水、干露8 d 的AEC 值均在40%以上，后期干藏直至10 d 才出现显著下降。AEC 值被认为是描述肌细胞能量状态的重要指标，用来反映受到环境胁迫的程度[21]。通常认为AEC 大于75%具有较好的活力[22]。然而，牡蛎在无任何胁迫状态下闭壳肌的AEC 值仅为53.9%，可能是因为牡蛎长期附着在其它物体上，导致闭壳肌不需要太高的能量[2]。此外，贝类肌肉AEC 值一般受季节的影响，这与其生殖周期有关[23]。有研究表明牡蛎闭壳肌六七月份AEC 值最高，10 月份最低，贻贝（Mytilus edulis）的AEC 值季节变化规律和牡蛎类似[24-25]。除季节影响外，养殖密度和贝龄也会影响AEC 值，高密度养殖的牡蛎普遍比低密度养殖的AEC 值低，而贝龄对AEC 值的影响大多取决于季节，不同季节变化是不同的[24]。

牡蛎模拟流通过程中pH 值变化如图1d 所示。牡蛎初始pH 6.78，运输1 d 后，pH 值显著降至6.56。复水后pH 值恢复至初始水平6.74，后期干藏过程中其逐渐降低。牡蛎运输过程中无氧呼吸产生的opine 类酸性代谢产物使pH 值降低，高温、撞击等胁迫更会加剧酸性代谢物的产生。有研究表明15 min 的机械振动就可使牡蛎的免疫功能出现显著的下降[26]。牡蛎复水后，氧气的参与使牡蛎的胁迫因素解除，pH 值回升。后期干藏过程中牡蛎避免了高温、撞击胁迫的影响，酸性代谢物产生速率较慢，pH 值缓慢下降。

SDH 是有氧代谢的指示酶，被用作缺氧胁迫程度的评价指标[27]。有研究表明，当日本沼虾和中华绒螯蟹面临低氧胁迫时，肌肉中SDH 活性会随低氧暴露时间的延长而降低[27-28]。太平洋牡蛎模拟流通过程中鳃SDH 活性变化如图2 所示。牡蛎初始SDH 活性为12.53 U/g，无水运输1 d 后显著降至8.95 U/g。复水后SDH 活性恢复至14.84 U/g，并维持至干藏8 d，第10 天显著下降至9.94 U/g。运输过程中牡蛎氧气供应不足，SDH 活性明显下降。复水后缺氧胁迫解除，琥珀酸脱氢酶的活性得到明显回升。后期干藏过程中，虽然牡蛎面临缺氧胁迫，但是贮藏温度较低，降低了自身的生理代谢，呼吸速率也明显降低，因此SDH 一直维持较高活性，干藏第10 天才出现显著下降。

图2 模拟流通过程中牡蛎鳃琥珀酸脱氢酶活性的变化Fig.2 The changes of SDH activity in gills of oysters during simulated supply chain

牡蛎模拟流通过程中活力指标主成分分析结果如图3 所示。对糖原含量、pH 值、ATP 相关化合物含量、AEC 值以及SDH 活性进行主成分分析发现，前2 个主成分的累计贡献率为98.3%，反映原指标的大部分信息。主成分分析将牡蛎大致分为4 组：C、T、D-E8、E10。初始点状态最好，无水运输1 d 后状态较差，复水后品质明显回升，干藏至第8 天仍保持较好品质，第10 天品质下降。

图3 主成分分析Fig.3 Principal component analysis

2.2 牡蛎模拟流通过程中呈味化合物含量变化

牡蛎模拟流通过程中软体呈味化合物含量变化见表2。呈味核苷酸主要有AMP 和IMP 两种，AMP 含量较低且波动不大。IMP 的TAV＞1，对呈味影响明显。IMP 初始含量为0.37 mg/mL，无水运输后降至0.25 mg/mL，复水后恢复至初始状态。IMP 含量后期干藏至第10 天才出现下降。IMP 是鲜味的增强剂，比味精强得多，与天冬氨酸、谷氨酸之间存在协同效应，可以增加鲜味。

牡蛎软体中游离氨基酸主要为牛磺酸和谷氨酸，其次为天冬氨酸和丙氨酸，与Murata 等[29]研究结果一致。其中，谷氨酸TAV＞1，说明只有谷氨酸对呈味影响明显。模拟流通过程中谷氨酸含量较为稳定，没有较大波动。牛磺酸在生物体内有调节渗透压的作用，对呈味不起作用。天冬氨酸和谷氨酸有酸味，然而，其钠盐会呈现鲜味。谷氨酸可与人工海水中钠离子结合形成呈鲜味的谷氨酸钠，并且L-谷氨酸和IMP 两种鲜味化合物之间也具有增强的协同作用[30-31]。丙氨酸是一种形成渗透压的物质，也是碳水化合物缺氧呼吸即酵解的主要终产物，在干露过程中大量积累[29]，这是丙氨酸无水运输后含量升高，复水后含量降低，并在后期干藏过程中逐渐上升的原因。

2.3 牡蛎模拟流通过程中微生物的变化

牡蛎模拟流通过程中细菌总数变化如图4 所示。无水运输后牡蛎细菌总数显著上升，复水后没有明显变化，并在后期干藏过程中逐渐上升。细菌总数可接受品质界限为107/g[32]，说明牡蛎在第10天仍可食用。长竹蛏和栉孔扇贝4 ℃贮藏12 h 时细菌总数没有明显变化，而当贮藏时间延长至24 h 时，细菌总数显著升高[33]。同样的，将蓝蟹在4 ℃下贮藏10 d 后细菌总数达到临界值[34]。

图4 模拟流通过程中牡蛎细菌总数变化Fig.4 Changes of aerobic plate count of oyster during simulated supply chain

牡蛎模拟流通过程中微生物物种注释以热图的形式展示（图5）。根据所有样本在属水平的物种注释及丰度信息，选取丰度排名前35 的属，根据其在每个样本中的丰度信息，从物种和样本两个层面进行聚类，绘制成热图。热图是一种二维呈现，可分为4 类：Ⅰ类以短波单胞菌属等为主，在恢复前期较多，在贮藏过程中含量较少，可能与温度的变化有关，对温度的要求较高。Ⅱ类以水栖菌属为主，运输后较多，经复水操作，明显降低，并在后期贮藏过程中含量较低。Ⅲ类微生物以交替假单胞菌属和希瓦氏菌属为主，主要存在贮藏后期，为腐败菌。Ⅳ类以弧菌、交替单胞菌和嗜冷杆菌属为主，贮藏中期比例明显增多，而在贮藏后期含量会显著降低。曹荣等[35]分析牡蛎闭壳肌冷藏（4 ℃）过程中微生物群落结构的变化规律，发现在属的水平上，弧菌属冷藏前期比例迅速下降，希瓦氏菌属和交替假单胞菌属在冷藏后期占优势，在牡蛎腐败过程中起重要作用。本研究中微生物群落结构的变化规律与其基本一致。

图5 模拟流通过程中牡蛎细菌物种丰度聚类热图Fig.5 Heat map of microorganism species abundance in oyster during simulated supply chain

3 结论

采捕后的太平洋牡蛎无水运输1 d 后进行复水处置，然后4 ℃下干藏，得到以下结论：

1）活力 无水运输1 d 后太平洋牡蛎质量、pH 值、ATP 含量和SDH 活性显著下降，复水后迅速回升至初始状态；后期干藏过程中糖原含量、pH 值逐渐降低，而AEC 值始终保持初始状态，干藏第10 天才显著下降。

2）呈味 呈味化合物中只有IMP 和谷氨酸TAV 值＞1，是影响牡蛎风味的重要物质。其中，谷氨酸在模拟流通过程中较为稳定，没有较大波动。IMP 含量仅在无水运输1 d 和干藏10 d 时较低。

3）微生物 牡蛎运输1 d 后细菌总数显著上升，复水后没有明显变化，并在后期干藏过程中逐渐上升，第10 天仍在可食用标准范围内。

太平洋牡蛎在“无水运输1 d-复水-干藏销售8 d”模式下接近于初始品质。在此模式下，节约销售成本的同时可较好地保持风味品质，研究结果可为牡蛎的运输、销售提供参考。