23 个柑橘品种果实油胞层类黄酮组分鉴定与抗氧化活性研究

刘阳，臧文静，梁潇，王岳，李鲜，孙崇德

（浙江大学果实品质生物学实验室/农业农村部园艺植物生长发育与品质调控重点开放实验室/园艺产品冷链物流工艺与装备国家地方联合工程实验室/园艺植物整合生物学研究与应用浙江省重点实验室 杭州 310058）

柑橘是世界大宗水果，具有重要的国民经济价值。我国幅员辽阔，有适宜柑橘栽培的多种气候和土地类型，为多种柑橘资源的积聚提供了良好条件。目前我国柑橘种植面积和产量均居世界首位，种植面积在2019 年达2 617 000 hm2，产量为4 584.54 万t[1]。

我国浙-闽-粤柑橘带作为传统柑橘产区，主要种植宽皮橘、柚、杂柑；长江中、上游柑橘带，即湖北、四川、重庆地区主要种植甜橙；赣南-湘南-桂北柑橘带主要种植甜橙及宽皮橘；鄂西-湘西柑橘带主要种植温州蜜柑和椪柑[2]。我国柑橘栽培品种丰富，利用价值多样，为食品和保健领域更高效、更全面利用柑橘资源提供了优势。

柑橘果实富含多种药用价值的生物活性物质，包括类黄酮、酚酸、萜类化合物、类胡萝卜素、生物碱、精油、果胶、膳食纤维以及VC 等[3]。随着这些功能组分的生物活性和药理作用机制的明晰，对柑橘生物活性物质的研究受到重视，其中类黄酮作为重要的一类活性物质，在不同种类柑橘果实中的研究中均有涉及[4]。类黄酮是指一类具有2-苯基色原酮（C6-C3-C6）为基本骨架的天然酚类化合物（图1），其结构中含有酚羟基、甲基、甲氧基等取代基团。目前柑橘属中发现的类黄酮多以苷的形式存在，主要为黄烷酮、黄酮和黄酮醇[5]。其中，含有4 个及以上甲氧基取代基的类黄酮称为多甲氧基黄酮（Polymethoxyflavonoids，PMFs），主要分布在柑橘果皮油胞层中[6]，因其富含较多的甲氧基团，亲脂性较高，故与一般黄酮相比具有更高的生物利用度，也具有更强的生物活性[7]。

图1 类黄酮基本结构Fig.1 General structure of flavonoids

类黄酮含量与类型在不同柑橘品种中的差异被大量研究所证实，例如，柚类中主要的类黄酮为柚皮苷、柚皮芸香苷、圣草枸橼苷、新橙皮苷和柚皮素[8]。柠檬中橙皮苷与圣草次苷含量较高[9]。宽皮橘果皮中PMFs 含量较高[10]。对我国特有的13 种柑橘属植物果实进行类黄酮含量分析发现，在柚类、橙类、宽皮橘类中，柚类果实的柚皮苷含量最高，宽皮橘类和橙类的橙皮苷含量最高[11]。柑橘果实不同组织部位中类黄酮的种类和含量也有较大差异。研究发现，将“瓯柑”和“胡柚”果实分为油胞层、白皮层、囊衣和汁胞4 个部分，测定类黄酮种类和含量，结果油胞层中富含PMFs，而白皮层中黄烷酮含量较高[4]。

现代流行病学研究表明，柑橘果实中丰富的类黄酮具有抗氧化[12]、抗肿瘤[13]、降血脂[14]和抗炎症[15]等作用。机体的氧化现象主要是因为存在自由基，自由基具有强氧化能力，在机体内与功能重要的生物大分子反应，使之丧失活性，逐渐引起细胞、机体功能障碍，对机体造成损伤、病变。而类黄酮自身结构赋予独特的理化性质，具有良好的抗氧化活性。类黄酮结构中的羟基不仅具有较强的自由基清除能力[16]，还与金属离子螯合，减少自由基的产生，达到抗氧化效果[17]。类黄酮也可通过抑制氧化酶活性和促进抗氧化酶活性来抵抗机体氧化损伤[18]。有关柑橘类黄酮抗氧化活性已有很多研究报道，例如，“瓯柑”和“胡柚”4 个部位粗提物均有一定的抗氧化活性，其中，油胞层具有最强的DPPH 自由基清除活性[4]。

目前，柑橘果实类黄酮的鉴定方法主要有色谱法、分子质谱法、核磁共振法、紫外-可见光吸收光谱法等。在柑橘类黄酮鉴定方面，色谱法应用较广泛，紫外-可见吸收光谱法应用相对较少。以往关于柑橘果实中类黄酮的研究，特别是不同柑橘品种果实中类黄酮的种类、含量及相关活性评价等，大多利用HPLC 通过比对标准品对已知结构类黄酮进行分析，而利用高分辨质谱等技术鉴别不同种类柑橘果实中的类黄酮研究较少。

本文以23 个品种的柑橘为材料，比较柑橘果实的品质。采用超高效液相色谱、高效液相色谱-高分辨质谱联用等多种技术，对柑橘果实油胞层中的类黄酮进行鉴定和抗氧化评价。从组分和活性角度挖掘柑橘组分和抗氧化活性信息，为其活性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

试验材料：23 个柑橘品种如图2 所示，于2017—2018 年果实商业采收期采集，挑选大小、色泽均匀，无机械伤、无病虫害的单果为试验材料。取果实油胞部分，用液氮处理后冷冻干燥至恒重，干样磨成粉末储存于-40 ℃条件下，备用。

图2 本试验用不同品种柑橘果实Fig.2 Different citrus varieties used in the present study

试验试剂：无水乙醇、甲醇、三氯甲烷、饱和碳酸钠、氯化氢、氯化铁、醋酸钠、二硫酸钾、氢氧化钾、磷酸二氢纳、磷酸氢二钠均为分析纯級试剂，上海国药控股股份有限公司；Folin-Ciocalteu 试剂、没食子酸（Gallic acid）、1-二苯基-2-2 三硝基苯肼（DPPH）、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、Trolox、ABTS、荧光素钠、AAPH，美国Sigma-Aldrich 公司；甲醇、乙腈为色谱纯级，Sigma-Aldrich 公司。

试验设备与仪器：真空冷冻干燥机（FM 25EL -85），SP Scientific；超声波清洗器（SK8200G），上海科导超声仪器有限公司；涡旋振荡器（Vortex-Genie2），美国Scientific Industeries；超速离心机（Eppendorf AG22331），德国；旋转蒸发仪Heidolph LABOROTA 4000-efficient，德国；固相萃取真空装置，Agela technologies；SPE 固相萃取柱，美国Waters；真空离心浓缩仪（Eppendorf centrifuge 5810Rz），德国；96 孔板，美国Corning；电子天平（BSA224S-CW），赛多利科学仪器北京有限公司；台式酶标仪，美国Biotek；一次性使用无菌注射器，江西洪达医疗器槭集团有限公司；一次性针头式过滤器（孔径0.22 μm），浙江同力信息科技有限公司；液相小瓶、LC-Q-TOF-MS/MS，美国Waters Corp.。

1.2 不同品种柑橘果实类黄酮抗氧化活性测定

1.2.1 类黄酮提取液的制备 称取23 个品种柑橘油胞层冻干粉0.2 g，按料液比1∶20 加入80%乙醇，超声辅助提取30 min（超声频率60 kHz，功率30 W），5 000 r/min 离心8 min，收集上清液。重复提取3 次，收集上清液用于后续总酚含量、抗氧化活性测定。设置3 个重复试验。

1.2.2 总酚含量测定 总酚含量测定采用Ghafoor 等[19]的方法并适当修改。在已添加4 mL 双蒸水的离心管中加入0.5 mL 稀释适当倍数的提取液，混合均匀后加入0.5 mL Folin-Ciocalteu（0.5 mol/L）试剂，静置3 min，加入1 mL 7%碳酸钠溶液，摇匀后在30 ℃水浴条件下静置2 h。待反应完全后，取200 μL 反应液加入96 孔板，用酶标仪在A760nm处测定吸光值。以没食子酸（Gallic acid）为标准品绘制标准曲线，计算各样品总酚含量，单位mg Gallic acid equivalent（GAE）/g DW。设置3 次重复试验。

1.2.3 抗氧化活性测定

1）DPPH法采用Zhang 等[20]的方法并适当改进。在无色96 孔板中加入2 μL 稀释适当倍数的提取液，再加入200 μL 60 mmol/L DPPH 溶液混匀，室温条件下避光反应2 h，使用酶标仪测定A517nm处吸光值。

2）FRAP法采用Zhang 等[20]的方法并适当改进。FRAP 工作液的制备：10 mmol/L TPTZ 溶液（使用40 mmol/L HCl 溶解）、20 mmol/L FeCl3溶液、300 mmol/L 醋酸钠缓冲液（冰醋酸调节pH 值至3.6）按照体积比1∶1∶10 混合，37 ℃孵育。在无色96 孔板中加入10 μL 稀释适当倍数的提取液，再加入90 μL FRAP 工作液，混匀，室温条件避光反应5 min，使用酶标仪在A593nm处测定吸光值。

3）ABTS法采用Floegel 等[21]方法并适当改进。ABTS 工作液的制备：7 mmo/L ABTS 溶液与2.6 mmo/L K2S2O8按体积比1∶1 混合，在室温条件下避光反应12h 后稀释28 倍。在无色96 孔板中加入10 μL 稀释适当倍数的提取液，再加入200 μL ABTS 工作液，混匀，室温条件放置5 min，使用酶标仪在A734nm处测定吸光值。

4）ORAC法采用Roy 等[22]的方法并适当改进。在黑色96 孔板中加入25 μL 稀释适当倍数的提取液，接着加入150 μL 40 nmol/L 荧光素钠溶液（磷酸缓冲液溶解），在37℃条件下静置10 min，加入25 μL 150 mmol/L AAPH 溶液（磷酸缓冲液溶解），使用酶标仪在激发波长485 nm、发射波长535 nm 处测定荧光强度，每2 min 记录读数，总测定时长为2 h。以25 μL 磷酸缓冲液为样品替代液（阴性对照），以25 μL，0～1 mg/mL Trolox 为标准品（对照），初始荧光值读数孔设定为不加AAPH 孔的读数。第n 次读数的相对荧光值计算公式：fn=第n 次荧光值（Fn）/初始荧光值（F0）。AUC=2×（f0+f1+...+fn）-fn-f0；Net AUC=AUCsample-AUCAAPH+。

以上试验均以Trolox 为标准品绘制标准曲线，计算各样品抗氧化能力。设置3 次重复试验。利用综合抗氧化能力复合指数（Antioxidant potency composite index，APC）[23]对23 个柑橘品种抗氧化能力进行综合评价。抗氧化方法测定结果中，抗氧化指数得分（APC 指数）=（样品值/最高样品值）×100，最终结果使用的APC 指数为4 种抗氧化方法APC 指数得分的平均值。

1.3 不同品种柑橘果实类黄酮的结构鉴定

1.3.1 样品制备 称取23 个品种柑橘果实油胞层冻干粉各0.2 g，按料液比1∶20 加入80%乙醇，用超声波清洗器超声30 min（超声频率60 kHz，功率30 W）后，5 000 r/min 离心8 min，收集上清液。重复提取3 次，收集上清液。使用旋转浓缩仪去除乙醇，用水溶液将梨形瓶中残留物质转移至离心管中。使用固相萃取真空装置，SPE Vac 12cc C18 柱（Waters，2g）经活化（12 mL 甲醇）、平衡（12 mL 去离子水）、上样、淋洗（100 mL 去离子水）、洗脱（10 mL 甲醇）5 个步骤，去除残留物质中糖酸等物质。将所得去糖样品置真空离心浓缩仪中，在30 ℃条件下浓缩得到粗提物粉末，存于4 ℃冰箱中，备用。

检测时，称取0.1 g 粗提物粉末溶于1 mL 色谱甲醇，充分溶解后使用一次性针头式过滤器（孔径0.22 μm）过滤，滤液加入液相小瓶中待用。

1.3.2 UPLC-Q-TOF-MS 检测方法 UPLC 部分使用Waters UPLC 系统，配备FTN 自动进样器，四元泵及UV 检测器。使用C18 色谱柱（2.1 mm×150 mm）。液相色谱（LC）条件：进样量3 μL；柱温30 ℃；流速1 mL/min；UV 检测器设在280 nm；流动相：A 相为去离子水，B 相为色谱乙腈（流动相均经30 min 超声波清洗器脱气模式脱气），线性梯度程序：0 min：3% B；0～5 min：3%～7% B；5～23 min：7%～20% B；23～28 min：20%～30% B；28～40 min：30%～55% B；40～42 min：55%～100% B；42～43 min：100%～3% B；45 min：3% B。

质谱使用AB Triple TOF 5600Plus系统。最佳MS 条件：气体1（空气）和气体2（空气）的压力设定为50 psi（344 737.95 Pa），帘式气体（N2）的压力设定为35 psi（241 316.57 Pa）。负离子模式：源电压-4.5 kV，源温度550 ℃。正离子模式（ESI）：源电压+5.5 kV，源温度600 ℃。允许的最大误差设置为±5 ppm。去聚集电位（DP）100 V；碰撞能量（CE）10 eV。基于IDA 的自动MS2在全扫描（1s）循环中针对8 种最强的代谢物离子进行扫描。前体离子和产物离子的m/z 扫描范围分别设定为100～1 500 u 和50～1 500 u。对于MS/MS 采集模式，参数几乎相同，只是将碰撞能量（CE）设置为（40 ±20）eV，离子释放延迟（IRD）设置为67，离子释放宽度（IRW）设置为25。精确质量在使用自动校准传递系统进行分析前自动校准。

1.4 不同品种柑橘果实类黄酮含量测定

1.4.1 样品制备 样品制备方法同1.3.1 节。

1.4.2 UPLC 检测方法 UPLC 体系：进样量2 μL；柱温25 ℃；流速0.3 mL/min；PDA 检测器检测280 nm 及330 nm；流动相：A 相为去离子水，B 相为色谱乙腈（流动相均经30 min 超声波清洗器脱气模式脱气），线性梯度程序同1.3.2 节。

1.4.3 标曲制作 精准称取标准品，用甲醇溶解，配得1 mg/mL 母液。依次将母液对半稀释，配制8个浓度梯度。使用上述UPLC 检测方法，分别进样。以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.5 统计分析

2 结果与分析

2.1 不同品种柑橘果实油胞层总酚含量和抗氧化活性

23 个柑橘品种果实油胞层总酚含量与抗氧化活性比较见表1，不同品种的总酚含量和抗氧化活性存在显著差异。不同品种柑橘果实油胞层总酚含量在4.38～21.10 mg GAE/g DW 之间，其中总酚含量最高品种为“桃叶橙”（21.10 mg GAE/g DW），“爱媛38” 总酚含量最低（4.38 mg GA/g DW）。

柑橘油胞层抗氧化活性各品种间差异显著。DPPH 自由基清除能力较强的品种为 “桃叶橙”（40.11 mg TEAC/g DW），较弱的品种为“爱媛38”（5.28 mg TEAC/g DW）。在FRAP 方法中，抗氧化能力较强的品种为 “本地早”（18.46 mg TEAC/g DW），较弱的品种为 “沙田柚”（5.82 mg TEAC/g DW）。ORAC 方法中，抗氧化能力较强的为“新会甜橘”（194.25 mg TEAC/g DW），较弱的为“爱媛38”（26.39 mg TEAC/g DW）。ABTS 方法中，抗氧化能力较强的品种为 “新会甜橘”（31.67 mg TEAC/g DW），最弱的 为 “爱媛38”（4.93 mg TEAC/g DW）。抗氧化效力复合指数分析表明（图3），油胞层中抗氧化能力最强的品种为“本地早”（APC=96.25），最弱的品种为“爱媛38”（APC=18.54）。

图3 23 个品种柑橘油胞层抗氧化效力复合指数Fig.3 APC Index in flavedo of 23 citrus cultivars

2.2 柑橘类黄酮UPLC 检测体系的优化

使用柑橘果实中具有代表性的类黄酮标准品对体系进行检测，结果显示：在280 nm 处，各标准品分离度较好。将标准品配成8 个浓度梯度后进行UPLC 检测，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到曲线R2均大于0.99，线性良好，表明本试验用UPLC 体系可用于柑橘提取液的定量、定性检测。

利用上述UPLC 体系建立的UPLC-Q-TOFMS 检测方法，对23 个柑橘品种果实油胞层的黄酮类粗提物进行鉴定。共鉴定出5 种黄酮-C-糖苷，4 种黄酮-O-糖苷，12 种黄烷酮-O-糖苷，32种PMFs 在内的53 种类黄酮（图4 和表2）。

图4 正离子模式下物质1～53 出峰顺序（280 nm）Fig4 .The peak number of substances 1-53 under positive ion mode（280 nm）

如表2 所示，鉴定出5 种黄酮-C-糖苷，鉴定物质1 为新西兰牡荆苷（Vicenin-2）；物质2 为地奥司明-6，8-二-C-葡萄糖苷；物质7 为根皮素-3'，5'-二-C-葡萄糖苷，对比已有文献，该物质是第1 次在柑橘中报道；物质8 为地奥司明-6-C-葡萄糖苷；物质17 为刺槐素-8-C-新橙皮苷。

鉴定出4 种黄酮-O-糖苷，即化合物6、11、14、18，分别鉴定为木犀草素-7-O-芸香糖苷、野漆树苷、新地奥司明、苏打其亭C 或B。

鉴定出12 种黄烷酮-O-糖苷，按照出峰顺序依次鉴定，物质3 为圣草次苷，物质4 为新圣草次苷，物质5 为芹菜素-7-O-葡萄糖苷，物质9 为柚皮芸香苷，物质10 为槲皮素-3-O-鼠李糖苷，物质12 为柚皮苷，物质13 为橙皮苷，物质15 为新橙皮苷，物质16 为地奥司明-O-葡萄糖苷，物质19 为橙皮素-7-O-鼠李糖苷，物质20 为香蜂草苷，物质21 为枸橘苷。

共鉴定出32 种PMFs，通过判断其特征性碎片离子，对比前人文献中一级质谱碎片、二级质谱碎片、保留时间、出峰顺序等信息，确定质谱中物质22、27、28、29 为单羟基-四甲氧基黄酮，物质23、25、26、52 为单羟基-三甲氧基黄酮，物质24为栀子黄素B，物质30 为麦黄酮，物质31 为三羟基二甲氧基黄酮，物质23、25、26、52 为单羟基-五甲氧基黄酮，物质33 为5，6，7，3'，4'-五甲氧基异黄酮，物质34 为异甜橙黄酮，物质38 为甜橙黄酮，物质47 为橘皮素，物质36 为四甲氧基黄酮，物质37、49 为六甲氧基黄酮，物质39 为四甲基-O-异黄芩素，物质43 为四甲基-O-野黄芩素，物质40 为二羟基三甲氧基黄酮，物质41 为六-O-甲基棉黄素，物质42 为川陈皮素，物质44 为5，4'-二羟基-3，7，8，3'-四甲氧基黄酮，物质45 为3，5，6，7，8，3'，4'-七甲氧基黄酮，物质46 为单羟基六甲氧基黄酮，物质48 为6-O-去甲橘皮素/7-O-去甲橘皮素，物质50 为5-羟基-6，7，8，3'，4'-五甲氧基黄酮，物质53 为柚皮黄素。

本研究的物质鉴定参考文献[24]～[30]，对比已有文献，有2 种类黄酮：根皮素-3'，5'-2-C-葡萄糖苷和槲皮素-3-O-鼠李糖基己糖苷是第1 次在柑橘中报道。其中，根皮素-3'，5'-2-C-葡萄糖苷在蜜树茶（Cyclopia intermedia）中被报道[31]；槲皮素-3-O-鼠李糖基己糖苷在澳洲蜜蜂（Tetragonula carbonaria）产出的蜂蜜中被报道[32]。

2.3 柑橘果实油胞层类黄酮组分的含量

以23 个柑橘品种果实为试验材料，采用超高效液相色谱（UPLC）技术鉴定其中主要的类黄酮。圣草次苷、新圣草次苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香蜂草苷、枸橘苷、野漆树苷、麦黄酮、异甜橙黄酮、甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素用标准品标定。在鉴定出的类黄酮中，PMFs 的定量以川陈皮素当量表示，其余无标准品的物质以新橙皮苷当量表示。

对不同品种柑橘果实油胞层进行UPLC 定量分析发现，品种间类黄酮含量差异显著。油胞层中检测到53 种类黄酮，包括黄酮-C-糖苷类、黄酮-O-糖苷类、黄烷酮-O-糖苷类、PMFs 类；含量较多的组分为圣草次苷、新圣草次苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、香蜂草苷和枸橘苷。横向对比类黄酮含量，“代代” 中圣草次苷和新圣草次苷含量最高，分别为444.86 μg/g DW 和229.83 μg/g DW；“夏红柑” 中柚皮芸香苷含量最高为1 151.61 μg/g DW；“香抛”中柚皮苷含量最高为5 579.04 μg/g DW；“茂谷柑” 中橙皮苷含量最高为18 528.85 μg/g DW；“夏红柑”中新橙皮苷含量最高为8 187.22 μg/g DW；“川红橘” 中香蜂草苷含量最高为607.34 μg/g DW；“光皮金橘” 中枸橘苷含量最高为364.13 μg/g DW。

PMFs 中甜橙黄酮及川陈皮素、橘皮素、5-去甲川陈皮素含量显著高于其它PMFs 类物质，横向对比PMFs 含量，“马水橘” 中异甜橙黄酮含量最高为65.66 μg/g DW；“马家柚”中甜橙黄酮含量最高为2289.23 μg/gDW；“茶枝柑” 中川陈皮素含量最高为2638.05 μg/g DW；“朱红橘”中橘皮素含量和5-去甲川陈皮素含量最高，分别为378.74 μg/g DW 和152.23 μg/g DW。

分析油胞层中所含类黄酮种类和含量，将数据归一化处理，做层次聚类分析。如图5 所示，不同品种柑橘的类黄酮种类和含量差异明显。橘类（“茶枝柑”“沙糖橘”“朱红橘”和“川红橘”）中橙皮苷含量较高，新橙皮苷含量较低，PMFs 种类和含量较多；橙类（“冰糖橙”“锦橙”“桃叶橙”和“广橙”）中圣草次苷、新圣草次苷和橙皮苷含量较高，PMFs 种类和含量相似；柚类的“香抛”“马家柚”和“沙田柚”聚为一类，其含有的类黄酮以新圣草次苷、柚皮苷和新橙皮苷为主，“马家柚” 在柚类中PMFs 含量相对较高；金柑类的“光皮金橘”油胞层中主要类黄酮为根皮素-3'，5'-二-C-葡萄糖苷、圣草次苷、新圣草次苷、柚皮芸香苷、香蜂草苷和枸橘苷；“光皮金橘”和“佛手”与其它柑橘品种所含类黄酮含量差异较大。

图5 23 个品种柑橘果实油胞层类黄酮含量的热图分析Fig.5 Heatmap analysis of flavonoids in the flavedo of 23 Citrus cultivars

3 讨论

随着生活水平的提高，果蔬的抗氧化活性成为大众关注的热点之一。钱井[33]测定35 个品种柑橘油胞层的总酚含量在11.52～27.55 mg GAE/g DW 范围，而本研究所测柑橘油胞层总酚含量在4.38～21.10 mg GAE/g DW 范围，二者结果相近。

不同抗氧化评价方法间存在差异，体外抗氧化评价常同时使用3～4 种抗氧化方法验证。本研究使用APC 指数综合评价不同品种柑橘的4 种抗氧化活性，结果显示，柑橘果实油胞层抗氧化能力最强的品种为“本地早”，抗氧化能力最弱的品种为“爱媛38”。

采用UPLC-Q-TOF-MS 和UPLC 技术，对23 个品种柑橘果实油胞层类黄酮进行鉴定，发现油胞层中类黄酮的种类及含量十分丰富。有研究表明，PMFs 物质只在油胞层中被检测到，造成这种差异的原因可能是油胞层中有丰富的油腺体，便于类黄酮，尤其是PMFs 类化合物的合成、转运和贮藏[34]。

通过分析各品种柑橘油胞层类黄酮物质含量，发现柚类中柚皮苷含量高于其它种类柑橘，橙皮苷含量虽极微，但检测出16.99～445.50 mg/g DW 的新橙皮苷。结合柚类中广泛分布的高含量柚皮苷，推测柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷可作为鉴别柚类和其它类柑橘的标志性物质。区别于其它柚类（香抛、沙田柚等），马家柚油胞层中有多种PMFs，造成这种差异的原因可能是马家柚油胞层具有许多凸起的油腺体颗粒，便于PMFs 的合成、贮藏和转运。具有橘、柚杂交遗传背景的夏红柑也含有高含量的柚皮苷。对橘类和杂柑类柑橘品种进行分析发现，橙皮苷与新橙皮苷含量呈负相关。在橘类中橙皮苷含量较高，而新橙皮苷含量极微或检测不到，推测新橙皮苷与橙皮苷在柑橘中作为标志性物质存在或存在相互转化关系。

4 结论

测定了23 个柑橘品种果实包括单果质量、可食率、可溶性固形物在内的基本生理指标。比较分析了23 个柑橘品种果实油胞层的抗氧化活性及总酚含量。在23 个柑橘品种油胞层中，共鉴定出53 种类黄酮，包括5 种黄酮-C-糖苷，4 种黄酮-O-糖苷，12 种黄烷酮-O-糖苷和32 种PMFs，这些类黄酮的种类和含量在不同品种间、果实不同部位间均存在差异。以25 种组分为特征性物质，将所收集的柑橘品种聚类为橙类、柚类、橘类及杂柑类。

柑橘家族存在较为复杂的亲缘关系，而果实中所含类黄酮可为柑橘品种进化提供鉴别依据。由于质谱的局限性，无法确定甲氧基及羟基连接的具体位点，后续研究可通过与核磁共振的碳谱、氢谱联用确定物质的具体分子结构。另外，进一步收集更多的柑橘种质资源，对其类黄酮物质进行鉴别与研究，选取相关性较大的类黄酮绘制品种鉴定图谱，构建信息库，为柑橘进化的推演和资源的综合利用提供理论依据。