连作丹参根际真菌的分离及拮抗菌RF15促生效应

车欣宇,林杭*,田丹*,韩明丽,徐夕雯,吴琛,杨文琪,潘国军,肖娜**

连作丹参根际真菌的分离及拮抗菌RF15促生效应

车欣宇1,林杭1*,田丹1*,韩明丽1,徐夕雯1,吴琛1,杨文琪1,潘国军2**,肖娜1**

1. 山东农业大学农学院, 山东 泰安 271018 2. 山东第一医科大学&山东省医学科学院生命科学学院, 山东 泰安 271000

为探明连作丹参主要病原菌类型及筛选拮抗菌，本研究以连作2年的丹参根际土壤为材料，采用梯度稀释涂布法进行根际土壤真菌的分离纯化，并利用离体叶片接种法进行致病性测定，同时结合平板对峙法筛选有应用价值的生防拮抗菌。结果表明，山东沂源县连作丹参地块中的主要土传病原真菌为腐皮镰刀菌（菌株编号RF3），在涂布丹参离体叶片5 d后，就表现出明显的致病能力，叶片病斑面积达到66.196%，致病级数达到4级。以该病原菌为指示菌，筛选到3株有较强拮抗作用的真菌，抑制率均超过30%，其中，根际真菌RF15拮抗效果最好，抑制率为32.81%。盆栽试验显示，接种接抗菌RF15显著促进了丹参幼苗株高和地上部生长，减少了须根数，经拮抗菌RF15处理后丹参幼苗地上部鲜重、株高、干重均显著高于未接菌对照，同时对病原菌抑制丹参幼苗生长有一定的改善效果。可见，根际真菌RF15存在一定的拮抗效果且对丹参幼苗具有较好的促生效果，有望进一步研究开发成为微生物肥料生产菌种。

丹参; 真菌; 拮抗; 促生效应

丹参（Bge.）又名紫丹参、赤参、红根等，以根入药，对心脑血管、肾功能不足等多种疾病有显著疗效，有极大的药用价值和经济价值。丹参也是中药学的研究热点，是药用植物研究中的主要模式植物[1]。近年来丹参产业迅速发展，人工大面积栽培成为获取丹参原料资源的主力方法，但丹参忌连作，连作障碍已成为制约丹参生产中的关键因素[2]。连作地块中的丹参生长发育受限，土传病害频发，如根腐病、根结线虫病、枯萎病等，严重影响丹参原材料的产量和品质，造成严重的经济损失[3]。山东作为丹参种植主产区之一，经调查发现，该主产区连续密集种植易使土壤中病原菌累积，影响丹参植株生长，产量和品质下降。

目前，在我国中药材农业生产中，绝大部分根和根茎类药材都存在不同程度的连作障碍，如人参、三七、地黄、丹参等，影响植物生长，造成产量和品质下降。目前有关缓解丹参连作障碍的焦点主要集中在土壤环境及其理化性质的改变、根系分泌物的化感自毒作用、土传病害等方面，对丹参根际微生物的研究报道相对较少。根际微生物资源丰富，存在某些可用于防治土传病害、改善土壤质量、促进植物生长等有益微生物，是生防微生物筛选的重要来源，在农业生产的可持续发展中具有重要意义[4,5]。已有大量研究表示，将分离获得的有益根际微生物接种到植物或土壤环境中，可以有效提高植物产量，避免使用化学药剂污染环境、使病原菌产生抗药性等问题的出现，实现绿色安全农业[6]。灰黄青霉菌CF3能够显著抑制附子根腐病病原菌尖孢镰刀菌和齐整小核菌的生长[7]。健康林下参叶片中分离出一株球毛壳菌FS-01，FS-01能抑制立枯丝核菌的生长，抑制率为24.37%，对立枯丝核菌引发的人参立枯病有一定防治效果[8]。枸杞根腐病是其栽植区一种常见的土传病害，从健康枸杞根际土壤中分离出的罗伯茨绿僵菌对根腐病的主要病原菌腐皮镰刀菌的抑制效果明显，抑菌率达39.80%[9]。从已有的研究基础来看，分离筛选可培养的优良拮抗根际微生物应用前景广阔，可进一步开发和利用。因此本研究以连作二年生丹参为研究对象，采用纯培养法对丹参根际土壤进行根际真菌的分离，通过离体叶片接种法和平板对峙法确定连作丹参的病原菌和拮抗菌，并采用盆栽实验对拮抗菌的促生效应做进一步研究，为缓解丹参的连作障碍、根际真菌的功能开发及利用提供理论基础，同时为药用植物根际可培养微生物资源库提供资源菌株。

1 材料与方法

1.1 材料来源

丹参根际土壤样品于2020年9月采自山东淄博沂源丹参种植试验基地（117°54'～118°31'E，35°55'～36°23'N）。样品部分为连作种植二年生丹参根际10 cm深土壤，4 ℃冰箱保存备用。

1.2 材料处理

将整个丹参根系挖出，轻轻抖动根系，将较大的土块和根系附着不紧密的土壤颗粒去除，用毛刷扫下黏附在丹参根系上的根际土壤，混合装入无菌自封袋进行收集，做好标记。土壤样品转移至实验室后使用2 mm网筛除去较大颗粒和杂物，4 ℃保存备用。

1.3 实验方法

1.3.1 根际真菌的分离纯化采用梯度稀释涂布平板法。称取连作种植二年生丹参根际土壤10 g，加入装有玻璃珠的90 mL无菌水的三角瓶中，28 ℃，160 r/min，震荡15～20 min，使其充分混匀，此时土壤悬浮液浓度已稀释10倍；吸取土壤悬浮液1 mL加入9 mL无菌水的离心管中，摇晃均匀，得到稀释倍数为10-2的悬浮液，按照此方法将土壤悬浮液依次稀释至10-4为止。分别吸取10-2、10-3、10-4三个梯度的土壤悬浮液100 µL涂布到孟加拉红培养基上，28 ℃恒温倒置培养3～5 d。待菌落特征明显后，挑取形态较大的菌落，采用三点接种法接种至PDA平板上进行纯培养，纯化培养多次，确定为无杂菌的单菌株为止。

1.3.2 致病性测定采用离体叶片接种法。选用温室盆栽中健康新鲜的丹参叶片，先用蒸馏水冲洗干净，再用75%酒精喷洒叶片进行消毒，待水分挥干后备用。将分离纯化的菌株在PDA平板上培养5 d，取菌饼置于PDB中，28 ℃，120 r/min摇床振荡发酵5～7 d，发酵好的培养基经双层无菌纱布过滤，制成发酵滤液，浓度调整为1.0×107cfu/mL，以空白PDB培养基为对照。用无菌接种针将叶片刺伤，形成小伤口，吸取500 µL真菌发酵滤液均匀涂布在有微伤口的丹参叶片上，每个处理涂布3片叶，3次重复。灭菌滤纸用无菌水润湿，包扎好以保持一定的湿度，25 ℃恒温培养，处理组除第一次涂布真菌发酵滤液之外，每天同对照组喷无菌水保持湿润，观察记录离体叶片情况。7 d后计算病斑相对面积。

病斑相对面积=叶片发病面积/叶片总面积×100%

1.3.3 拮抗菌的筛选采用平板对峙法。以鉴定出的连作丹参强病原菌腐皮镰刀菌为指示菌株，将病原菌和待测非致病菌分别接入PDA平板中，两菌块相距4 cm，设置仅接种病原菌的平板为对照，将病原菌接种于培养皿中心十字交叉处，每个处理设3次重复，28 ℃恒温暗培养，观察病原菌的生长情况，5 d后采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算抑制率。

抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

1.3.4 拮抗菌对丹参幼苗生长的影响丹参种子育苗生长至3-4片真叶后，开始移栽，每盆栽植3株大小形态基本一致的幼苗，设置清水（CK）、拮抗菌、病原菌（NC）和拮抗菌+病原菌四个处理，每个处理设置5个重复，处理组各浇灌200 mL对应菌发酵液，对照组浇灌等量无菌水。25 ℃光照16 h与黑暗8 h交替，其中菌株发酵液处理组只第一次用菌株发酵液浇灌，后期管理与对照组一样，用无菌水浇灌。40 d后测定生长指标：测量幼苗植株株高（cm）、根长（cm）、地上部和根鲜重（g），45 ℃烘干2 d测定地上部和根干重（g）。

1.3.5 菌株鉴定将纯化后的病原菌和拮抗菌菌株在PDA平板上培养5 d后，观察记录菌落特征。记录菌落正面、背面颜色、菌落边缘形状、均匀度，菌落质地，待平板中长出子实体后，用挑针挑取少许，制作临时玻片，在光学显微镜下观察分生孢子形态。菌株由青岛睿博兴科生物技术有限公司进行测序，在GenBank上提交测序结果，登录NCBI网站使用BLAST分析工具与已知同源性真菌菌株进行比较，构建发育树，找出最相似种属，确定为该菌株的鉴定结果。

1.4 统计分析试验数据利用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statistics 22软件进行数据处理和统计分析，LSD法进行多重比较，判断差异显著性。

2 结果与分析

2.1 根际真菌的分离纯化

共分离纯化出53株根际真菌，根据真菌的外观形态及微特征观察发现，初步分为8属，见表1。其中，曲霉属（sp.）、青霉属（sp.）、根霉属（sp.）、镰孢菌属（sp.）为优势菌群。

表 1 不同属丹参根际真菌

2.2 分离真菌致病性测定

采用离体叶片接种法，涂布真菌发酵液7 d后，接种的丹参离体叶片中有14组处理对丹参叶片存在致病性，见表2，能引起叶片褐化、腐烂，形成病斑，其中病斑相对面积在60%以上的根际真菌有2株，分别为RF3和RF37。病原菌RF3发酵液涂布丹参叶片后，7 d后，病斑完全覆盖叶片表面且叶片明显失黄。涂布病原菌RF37发酵液至第7 d，病斑迅速扩散颜色逐渐变深，叶片萎蔫且出现发霉症状（如图1）。

表 2 不同根际真菌处理病斑相对面积

“-”表示无致病性

“-” Indicates non-pathogenicity

图 1 致病性试验

2.3 病原菌形态特征观察

菌株RF3在PDA培养基28 ℃黑暗环境下培养5 d后，菌株生长较快，基本长满培养皿，菌落白色，边缘整齐，气生菌丝较发达，菌落呈绒毛状，不产色素；菌株RF37在PDA培养基上生长迅速，边缘整齐，菌丝发达初为白色，菌落呈絮状，背面呈黄褐色，表面稀疏（如图2）。其菌落形态特征、孢子形状符合镰孢菌属特征描述。

图2 病原菌菌落形态

2.4 病原菌分子鉴定结果

将获得的RF3和RF37菌株分别与20株Fusarium参考菌株的ITS基因序列进行比对，采用最大似然法（Maximum Likelihood）构建多基因系统发育树。Blast序列分析表明，RF3与腐皮镰刀菌strain FJCE（登录号KY013237.1）和腐皮镰刀菌isolate CEL40（登录号MN173137.1）的菌株节点处bootstrap值为97。菌株RF37与腐皮镰刀菌XHL13041501 （登录号KJ696540.1）和腐皮镰刀菌ALAL-1（登录号MW923790.1）菌株序列的同源性为99%（图3）。

因此根据形态学和分子生物学分析，病原菌株RF3和RF37均为腐皮镰刀菌（）的成员。

图 3 菌株RF37和菌株RF3基于rDNA-ITS序列构建系统发育进化树

2.5 菌株RF15对腐皮镰刀菌的抑制作用

从丹参根际土壤中共分离出3株对腐皮镰刀菌具有拮抗作用的真菌，其中菌株RF15的拮抗效果最好，能够明显抑制腐皮镰刀菌菌落的生长，经计算，菌株RF15对腐皮镰刀菌的抑菌率达32.81±0.68%，表现出较强的抑制能力（见图4）。

图 4 菌株RF15对腐皮镰刀菌的拮抗作用

A：腐皮镰刀菌对照；B：菌株RF15与腐皮镰刀菌的平板对峙

A：The control of；B：Inhibition of strain RF15 against.

2.6 菌株RF15发酵液对丹参幼苗生长的影响

2.6.1 菌株RF15发酵液对丹参幼苗长势的影响菌株发酵液灌根处理40 d后，观察丹参幼苗植株，从整株幼苗形态可以发现，不同处理对丹参幼苗地上部及须根数影响较为明显。与清水对照（CK）相比，菌株RF15处理（NC）丹参幼苗可以促进株高和地上部生长，减少须根数；经病原菌腐皮镰刀菌处理（PT）后，抑制了丹参幼苗的生长，丹参幼苗地上部弱小，根系细小，表现出一定的抑制作用，这与致病性测定结果一致；而将拮抗菌与病原菌混合（NC+PT）施入后明显改善（图5）。

图 5 不同菌发酵液对丹参幼苗长势的影响

CK：清水对照；NC：菌株RF15；PT：病原菌；NC+PT：菌株RF15+病原菌

CK：The control of water；NC：The treatment of strain RF15；PT：The treatment of pathogen；NC+PT：The mixture of strain RF15 and pathogen

2.6.2 菌株RF15对丹参幼苗生物量的影响不同发酵液灌根处理对丹参幼苗根长和根鲜重的影响并不明显，而株高、地上部鲜重和干重却有明显差，见表3。菌株RF15（NC）处理下的株高、地上部鲜重和干重最高，分别为CK的18.27%、58.98%、23.79%和19.43%，差异达到显著水平，表明NC处理对丹参幼苗生长存在一定的促进效应。施加病原菌发酵液（PT）40 d后，丹参幼苗生物量低于清水对照，抑制了丹参幼苗的生长，而将菌株RF15和病原菌混合处理后（NC+PT），丹参幼苗的生物量均与PT组差异显著，对病原菌造成的抑制作用存在一定的改善效果。

表 3 不同菌发酵液对丹参幼苗生物量的影响

注：表中不同小写字母表示不同处理间的差异（<0.05）。

Note: Different lowercase letters in the table indicate the difference between different treatments (<0.05).

2.7 菌株RF15分子生物学鉴定结果

通过对拮抗菌RF15的ITS保守序列扩增产物进行测序，根据测序结果，在Gen Bank数据库中进行Blast比对，搜索同源菌株序列，比对分析后选定20个参考菌株构建进化树，见图6。Blast序列分析表明，菌株RF15与棘孢曲霉s srain M9（登录号JQ670921.1）的同源性达到99%，可确定该菌株是一株棘孢曲霉（）。

图 6 菌株RF15基于rDNA –ITS序列构建系统发育进化树

3 结论与讨论

本实验对山东沂源县连作丹参根际土壤采样，分离纯化培养根际真菌，通过离体叶片进行致病性测定，结合形态特征、分子生物学鉴定，确定分离获得的菌株RF3为腐皮镰刀菌（）。在调查中发现，连作地块中丹参易发生土传病害，如根腐病、枯萎病、叶斑病等。Yang J等报道层出镰刀菌（）是河南省丹参种植主产区根腐病的主要病原菌[10]；在山东临沂丹参主产区出现一种苗枯病，Yi JL等研究发现该病害的病原菌为立枯丝核菌（AG1 – IA）[11]；丁远杰等从自然感染丹参病毒病原植株上分离得到一株病毒分离物，经生物学接种、电镜观察及序列分析后发现丹参病毒病的病原为黄瓜花叶病毒[12]。镰刀菌属是非常庞大的一个属，是根腐病、枯萎病等多种土传病害的病原真菌，分布广泛，种类繁多，存在多个专化型，而且不同镰刀菌种间差异微小。目前有关丹参连作地的病原菌分离鉴定的研究较少，研究热点主要集中于因连作障碍引发的多种土传病害，如根腐病是丹参连作地中的最重要病害，全国各主产区根腐病的病原物有所差异，山东和四川丹参种植基地的根腐病病原主要为腐皮镰刀菌（），也有病原菌报道为木贼镰刀菌（（Corda）Sacc.）。枯萎病是丹参生产的第二大病害，其主要病原菌为尖孢镰刀菌Schlecht[13-15]。

目前对于缓解丹参连作障碍，防治土传病害频发等防治措施大多停留在农业措施和化学防治阶段。采取化学药剂防治措施不但污染环境而且易造成抗药性增加等问题，利用有效的生防拮抗菌株会解决许多由于不当的化学防治带来的环境问题，而且恰当使用更能够省时省力[16]。本研究以连作丹参病原菌腐皮镰刀菌为靶标进行高效拮抗菌的筛选，得到一株拮抗效果好的真菌菌株RF15，并进行了丹参幼苗盆栽促生试验和分子生物学鉴定。结果显示，该菌株为棘孢曲霉（），接种菌株RF15发酵液后对丹参幼苗具有一定的促生作用，同时对病原菌抑制幼苗生长存在一定的改善效果。棘孢曲霉作为生防菌已见报道，如胡小加等在油菜土壤中分离出的棘孢曲霉对油菜核盘菌菌核的致死率可达到83.3%，盆栽试验表明，其对油菜菌核的萌发率可降低18.3%[17]。棘孢曲霉亦可用于防治虫害，将棘孢曲霉分生孢子悬浮液接种到柑桔木虱成虫体表后，发现随着分生孢子浓度增加，成虫死亡率会逐渐增加[18]。植物的生长离不开激素的调节作用，研究表明，棘孢曲霉真菌可通过促进植物产生生长素，从而影响植物的生长发育[19]。本课题在后期的实验中也将开展相应的丹参整株成长期盆栽及大田实验，以进一步验证添加菌株RF15后生防制剂对丹参病害的生防效果。

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Isolation of Rhizosphere Fungi fromBge and the Growth-promoting Effect of Antagonist RF15

CHE Xin-yu1, LIN Hang1*, TIAN Dan1*, HAN Ming-li1, XU Xi-wen1, WU Chen1, YANG Wen-qi1, PAN Guo-jun2**, XIAO Na1**

1.271018,2.271000,

In order to find out the main pathogenic bacteria types of continuous croppingand screen antagonistic bacteria, this study used the rhizosphere soil of continuous croppingfor two years as the material, separated and purified rhizosphere soil fungi by gradient dilution coating method, determined the pathogenicity by in vitro leaf inoculation method, and screened the biocontrol antagonistic bacteria with application value in combination with the flat-plate confrontation method. The results showed that(strain number RF 3) was the main soil-borne pathogenic fungus in continuous cropping ofBunge in Yiyuan County, Shandong Province, which showed obvious pathogenicity after smearingBunge leaves in vitro for 5 days, with the leaf lesion area of 66.196% and the pathogenicity grade of 4. Taking the pathogenic bacteria as indicator bacteria, three strains of fungi with strong antagonistic effect were screened out, and their bacteriostatic rates were all over 30%. Among them, rhizosphere fungus RF 15 had the best antagonistic effect, with an inhibition rate of 32.81%. Pot experiment showed that inoculation with antibiotic RF 15 significantly promoted the plant height and the growth of aerial parts ofseedlings, and reduced the number of fibrous roots. The aboveground fresh weight, plant height and dry weight ofseedlings treated with antagonistic bacterium RF 15 were significantly higher than those of the uninfected control, and it could improve the pathogenic bacteria that inhibited the growth ofseedlings. Therefore, rhizosphere fungus RF 15 has certain antagonism and good growth promoting effect onseedlings, and it is expected to be further researched and developed into a microbial fertilizer production strain.

Bge; fungi; antagonism; growth promoting effect

R282.71/S154.3

A

1000-2324(2022)06-0832-07

2022-03-04

2022-05-25

山东省自然科学基金面上基金(ZR2021MB087);国家自然科学基金青年基金(82004014);山东省中医药科技计划(2021Q083)

车欣宇(1998-),女,硕士研究生,主要研究方向作物栽培与耕作学.E-mail:091303cxy@126.com

林杭(1998-),男,硕士研究生,主要研究方向药用植物微生物资源与利用. E-mail:2710156647@qq.com

田丹(1998-),女,硕士研究生,主要研究方向作物栽培与耕作学. E-mail:1336525402@qq.com

Author for correspondence. E-mail:15650096678@126.com; xiaona198707@126.com

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.06.003